コロニー形成単位(CFU)のカウントは微生物学の標準的な手法ですが、時間がかかり、多くの寒天プレートが必要です。当社の技術は、両方の時間寒天プレートにおいて、従来のCFU計数法に比べて100倍の利点があります。この方法論を適用して、小動物モデル、特にショウジョウバエの腸内細菌叢を測定しました。
このプロトコルは、グノトビオティックスハエのCFUを定量化するためのシンプルで高速かつ自動化された方法です。このプロトコルは、CFUを撮影するためのDIY製の機器と、それらをカウントを自動化するためのカスタムソフトウェアを使用したワークフローを提供します。このプロトコルは、より効率的なめっき法とCFU計数法が役立つ微生物学実験に使用できます。
ハエを効率的に扱い、プレートを見つけるには手先の器用さが必要なので、これを実践する必要があります。自動計数ソフトウェアを使用するには、しきい値を判断する必要があるため、領収書を手動計数と比較して、実験に最適なパラメーターを特定する必要があります。 手順をデモンストレーションするのは、技術を開発した私の研究室の研究者であるRen Dodgeです。まず、0.5ミクロンのガラスビーズをビーズ測定トレイに注ぎます。
すべてのウェルがいっぱいになって水平になるようにトレイにビーズを広げます。次に、余分なビーズを円錐形のチューブにブラシで取り除きます。次に、セミスカートのPCRプレートを逆さまに測定トレイに置き、測定トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。
次に、すばやく裏返してビーズを移します。PCRプレート表面から余分なビーズを取り除きます。すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認してください。
必要に応じて、計量スクープを使用して単一のウェルにビーズを追加します。次に、プレートをアルミホイルとオートクレーブで覆います。プレートを使用する前に、96チャンネルピペッターを使用してハエを追加する直前に、各ウェルに100マイクロリットルのPBSを追加します。
麻酔をかけたハエを表面滅菌するために、小さな漏斗を使用してバイアルから1.5ミリリットルの微量遠心チューブにハエを移します。直ちに1ミリリットルの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて、10秒間反転混合します。次に、ハエを吸引しないようにしながら、P-1000ピペットでエタノールを吸引します。
最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にしてベンチで数回強く叩いて、ハエがキャップに入るようにします。チューブを開いた後、鉗子を使用してハエをウェルに分配し、各ウェルに1匹のハエを入れます。ロード中にプレートを氷の上に置いて、ハエに麻酔をかけたままにします。
ウェルの近くにある浮遊ビーズは、ホイルシールを破り、漏れを引き起こす可能性があるため、除去してください。シーリングフォイルの鈍い側がプレート上で下を向き、光沢のある側がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラーを5秒間しっかりと押し、ハンドアプリケーターで磨いてホイルを固定します。
ハエを5分間均質化します。ハエが完全に均質化され、溶液が着色されていることを確認してください。シーリングホイルから液体を除去するには、30 Gのミニプレートスピナーでビーズプレートを350秒間回転させ、フライホモジネートの液滴が飛散しないように、プレートを保持しながらホイルを取り外します。
蓋を開けた長方形のMRS寒天成長プレート3枚をバイオセーフティキャビネットに入れ、少なくとも10分間乾燥させます。96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを添加して、2つの希釈プレートを準備します。P-20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。
サンプルプレートから11.1マイクロリットルのホモジネートを吸引して1:10に希釈します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの滅菌PBSを含む最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600 RPMで10秒間保持します。
少なくとも10回上下にピペッティングして再度混合します。11.1マイクロリットルを最初の希釈プレートから2番目の希釈プレートに移し、さらに希釈するために混合ステップを繰り返します。プレートをスポッティングするには、各ウェルから2マイクロリットルを96チャンネルピペッターに入れます。
寒天に刺さらないように、ピペッターヘッドをゆっくりとプレート上に下げ、すべてのスポットが分注されていることを確認します。次に、液体スポットが寒天にすばやく浸り、一緒に流れないことを確認します。原稿に記載されているように、残りの希釈プレートに対してメッキプロセスを繰り返します。
液体が寒天に完全に吸収されたら、プレートを反転させ、コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします。プレートを論理的に整理し、撮影中は特定の順序で保管します。A1がすべてのプレートの左上隅になるように向きを変えます。
プレートの蓋を外した後、A1を正しい隅に向けてプレートをステージに置きます。プレートをイメージします。画像をコンピューターに転送し、実験名、メディアタイプ、希釈係数、その他の関連する詳細を含む名前を変更します。
定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名は、出力スプレッドシートの各カウント セットの列タイトルになります。フォルダー内に [トリミング済み] と [領収書] という名前のサブフォルダーを作成します。
これらのフォルダーは、出力ファイルを受け取ります。次に、ImageJからクロプタキュラープラグインを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。ソースフォルダを選択するためのダイアログボックスがポップアップ表示されます。
OK をクリックします。ソースフォルダを選択し、[開く]をクリックします。次に、ダイアログボックスで[OK]をクリックして、宛先ディレクトリを選択します。保存先フォルダを選択し、[開く]を押します。
画像がすでにまっすぐになっている場合は、スペースキーを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて画像をまっすぐにします。画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を再描画します。
次に、カウント領域の境界ボックスを描画し、すべてのスポットがセル内に入るまでそのサイズと比率を調整します。カーソルを境界ボックスの外側にドラッグして、グリッドを更新します。グリッドに問題がなければ、Space キーを押します。
プラグインはすべての写真が同じように整列していることを前提としているため、次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認してください。これが正確な場合は、スペースキーを押して続行します。それ以外の場合は、前と同じように画像を傾き補正します。
グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。必要に応じて調整し、スペースを押します。カウントオンイットを起動し、グリッドアイアンを選択します。
上限と下限のピクセル強度値に基づいてコロニー強度のしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。しきい値が十分になったら、[アクションが必要] ダイアログ ボックスで [OK] をクリックし、[OK] をクリックして続行します。
最初の画像では、続行するか、セットアップメニューに戻るかのオプションが与えられています。バッチ処理を続行するには、[OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。前に作成した [領収書] フォルダーを使用します。
最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。[OK] をクリックしてこれらの設定を使用するか、設定を調整します。ソフトウェアによって生成されたカウントレシートを確認し、カウントエラーを手動で修正します。
ImageJプラグインは統計的に正確ですが、エラーが発生します。領収書を証明して外れ値を調べ、ミスカウントを特定します。ソフトウェアは、CFUデータを領収書と同じフォルダにCSVファイルとして保存します。
Lactobacillus plantarumにコロニーを形成したハエでは、接種後に無菌食品に移されなかったハエと比較して、毎日無菌食品に移され、毎日移送され、分析の4時間前に無菌食品に保持され、分析の4時間前に滅菌寒天に保持されたハエの細菌が有意に減少した。アセトバクター・インドネシアセンシスを投与したハエでも同様の結果が観察され、移植、移植後、および除去されたハエはCFUの有意な減少を示しましたが、洗浄は測定可能な効果をもたらさず、CFUの減少はキューティクルではなく腸からの細菌の除去によるものであることが示唆されました。スポットあたり2〜25コロニーのスポットでのCFUカウントは、従来の方法と比較して差を示さなかった。
平均35コロニーのスポットは、対照スプレッドプレートよりも低いCFUを示した。この減少は、密集したスポットでコロニーが重なっていることが原因である可能性があります。プレート写真では、コロニー強度は背景より300%高かった。
ラクトバチルスプランタルムmCherry陽性コロニーは、mCherry陰性コロニーよりも1, 000%高い赤色強度を示しました。アセトバクター・インドネシアエンシスGFP陽性コロニーは、GFP陰性コロニーよりも200%高い緑色強度を示した。ImageJ用のカウントオンイットプラグインは、プレート写真からのCFUカウントを自動化します。
コロニーは正確に検出され、手動カウントに匹敵するカウントがあります。カウントレシートは、誤カウントを識別するために使用できます。サイズ閾値と蛍光波長を変更することで、異なるコロニー形態を個別にカウントすることができます。
ビーズビーズをする前に、プレートがしっかりと密封されていることを確認することが不可欠です。また、測定値を校正するためのポジティブコントロールを設計することも重要です。また、この手法を使用して、96ウェルプレート内の細菌のin vitro集団を研究し、細菌の混合群集を研究することができます。
この技術により、腸のコロニー形成およびコロニー形成の生物学的変異を測定するためのハイスループットスクリーニングアプローチが可能になります。
