A contagem de unidades formadoras de colônias, ou UFCs, é uma técnica padrão em microbiologia, mas é lenta e requer muitas placas de ágar. Nossa técnica oferece uma vantagem de cem vezes em relação aos métodos tradicionais de contagem de UFC em ambas as placas de ágar tempo. Aplicamos a metodologia para medir o microbioma intestinal de pequenos modelos animais, particularmente moscas da fruta.
Este protocolo é uma maneira simples, rápida e automatizada de quantificar UFCs em moscas gnotobióticas. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho com instrumentação fabricada por DIY para fotografar as CFUs e software personalizado para automatizar a contagem. Este protocolo poderia ser usado em qualquer experimento de microbiologia onde métodos mais eficientes de chapeamento e contagem de UFC poderiam ser úteis.
Manusear as moscas de forma eficiente e detectar as placas requer destreza manual, por isso isso deve ser praticado. O uso do software de contagem automatizada requer julgamento sobre o limiar, portanto, os recibos devem ser comparados com contagens manuais para identificar os melhores parâmetros para o seu experimento Demonstrando o procedimento estará Ren Dodge, um pesquisador do meu laboratório que desenvolveu a técnica. Para começar, despeje contas de vidro de 0,5 mícron na bandeja de medição de contas.
Espalhe as contas na bandeja para que todos os poços estejam cheios e nivelados. Em seguida, escove o excesso de contas em um tubo cônico. Agora, coloque uma placa de PCR semi-rodapé de cabeça para baixo na bandeja de medição e alinhe-a com os poços, encaixando-a no recuo na bandeja de medição.
Em seguida, vire-o rapidamente para transferir as contas. Remova o excesso de contas da superfície da placa de PCR. Certifique-se de que todos os poços contenham contas.
Se necessário, use uma colher de pesagem para adicionar contas a um único poço. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio e autoclave. Antes de usar a placa, adicione 100 microlitros de PBS a cada poço imediatamente antes de adicionar as moscas usando o pipetter de 96 canais.
Para esterilizar à superfície as moscas anestesiadas, transfira moscas do frasco para injetáveis para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando um pequeno funil. Pulverize imediatamente um mililitro de etanol a 70% no tubo, feche o tubo e misture por inversão por 10 segundos. Em seguida, aspirar o etanol com uma pipeta P-1000, evitando aspirar moscas.
Após a lavagem final do PBS, feche o tubo e bata-o com força no banco algumas vezes com a tampa virada para baixo para que as moscas entrem na tampa. Depois de abrir o tubo, dispense moscas nos poços usando fórceps e coloque uma mosca em cada poço. Mantenha as moscas anestesiadas, mantendo a placa no gelo durante o carregamento.
Remova as contas perdidas perto dos poços, pois elas podem quebrar o selo da folha e causar vazamento. Certifique-se de que o lado opaco da folha de vedação esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante esteja voltado para cima em direção ao selador térmico. Pressione o selador térmico firmemente por cinco segundos e polir com o aplicador manual para fixar a folha.
Homogeneize as moscas por cinco minutos. Certifique-se de que as moscas estão completamente homogeneizadas e a solução fica colorida. Para remover o líquido da folha de vedação, gire a placa de contas por 30 segundos em um mini girador de placa a 350 G.Remova a folha enquanto segura a placa para evitar espirrar gotículas de homogeneizado de mosca.
Coloque três placas retangulares de crescimento de ágar MRS com as tampas abertas no armário de biossegurança para secar por pelo menos 10 minutos. Prepare duas placas de diluição adicionando 100 microlitros de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços usando um pipetter de 96 canais. Carregue um rack de pontas P-20 no pipetter de 96 canais.
Efectuar uma diluição 1:10 aspirando 11,1 microlitros de homogeneizado da placa de amostragem. Agora, dispense-o na primeira placa de diluição contendo 100 microlitros de PBS estéril por poço. Manter a placa de diluição no agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.
Misture novamente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Transferir 11,1 microlitros da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir as etapas de mistura para quaisquer diluições adicionais. Para detectar placas, carregue dois microlitros de cada poço no pipetter de 96 canais.
Abaixe a cabeça do pipetter lentamente sobre a placa, evitando esfaquear o ágar, e certifique-se de que todas as manchas foram dispensadas. Em seguida, verifique se as manchas líquidas mergulham rapidamente no ágar e não correm juntas. Repetir o processo de chapeamento para as restantes placas de diluição, conforme descrito no manuscrito.
Uma vez que o líquido tenha sido completamente absorvido pelo ágar, inverta as placas e incube-as até que as colônias tenham atingido o tamanho ideal. Organize as placas logicamente e mantenha-as em uma ordem específica durante a fotografia. Oriente-os para que a A1 fique no canto superior esquerdo para todas as placas.
Depois de retirar a tampa da placa, coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. Imagine as placas. Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e outros detalhes pertinentes.
Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Os nomes de arquivo que distinguem as placas se tornam títulos de coluna para cada conjunto de contagens na planilha de saída. Crie subpastas chamadas Recortado e Recibos na pasta.
Essas pastas receberão os arquivos de saída. Agora inicie o plugin Croptacular do ImageJ e clique em OK para começar a cortar. Uma caixa de diálogo para escolher a pasta de origem será exibida.
Clique em OK. Selecione a pasta de origem e clique em Abrir. Em seguida, clique em OK na caixa de diálogo para escolher o diretório de destino. Selecione a pasta de destino e pressione Abrir.
Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve se tornar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem não aparecer reta.
Em seguida, desenhe uma caixa de limite para a área de contagem e ajuste seu tamanho e proporção até que todos os pontos estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.
Como o plug-in pressupõe que todas as fotos estejam alinhadas de forma idêntica, certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo que a primeira. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes.
A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior. Ajuste se necessário e pressione Espaço. Inicie o Count-On-It e selecione Gridiron.
Defina a intensidade da colônia limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e um inferior. Torne o limiar o mais rigoroso possível, enquanto ainda seleciona todas as colônias. Clique em OK na caixa de diálogo Ação Necessária quando o limite for satisfatório e clique em OK para continuar.
Na primeira imagem, é dada a opção de prosseguir ou retornar ao menu de configuração. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta Recibos criada anteriormente.
Após a primeira imagem, as imagens a seguir terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustar as configurações. Revise os recibos de contagem que são produzidos pelo software e corrija manualmente quaisquer erros de contagem.
O plugin ImageJ é estatisticamente preciso, mas ocorrem erros. Comprove os recibos para examinar valores atípicos e identificar erros de contagem. O software salva os dados da CFU como um arquivo CSV na mesma pasta que os recibos.
Para moscas colonizadas com Lactobacillus plantarum, houve uma diminuição significativa de bactérias para moscas que foram transferidas diariamente para alimentos estéreis, transferidas diariamente, mantidas em alimentos estéreis quatro horas antes da análise ou transferidas diariamente e mantidas em ágar estéril quatro horas antes da análise em comparação com moscas que nunca foram transferidas para alimentos estéreis após a inoculação. Resultados semelhantes foram observados em moscas alimentadas com Acetobacter indonesiensis, onde moscas transferidas, pós-transferidas e limpas mostraram uma redução significativa nas UFCs, mas a lavagem não teve um efeito mensurável, sugerindo que a redução nas UFCs foi devido à depuração de bactérias do intestino e não da cutícula. A contagem de UFC em pontos com 2 a 25 colônias por ponto não apresentou diferença em relação ao método tradicional.
As manchas com média de 35 colônias apresentaram UFCs inferiores às placas de espalhamento controle. Essa redução pode ser devido à sobreposição de colônias em pontos densos. Nas fotos de placas, a intensidade da colônia foi 300% maior do que o fundo.
As colônias de Lactobacillus plantarum mCherry-positivas apresentaram intensidade vermelha 1.000% maior do que as colônias mCherry-negativas. As colônias positivas para GFP de Acetobacter indonesiensis apresentaram intensidade verde 200% maior do que as colônias negativas para GFP. O plugin Count-On-It para ImageJ automatiza a contagem de CFU a partir das fotos da placa.
As colônias são detectadas com precisão, com contagens comparáveis à contagem manual. Os recibos de contagem podem ser usados para identificar erros de contagem. A alteração dos limiares de tamanho e dos comprimentos de onda de fluorescência permite que diferentes morfologias de colônias sejam contadas separadamente.
É essencial certificar-se de que a placa está bem selada antes do grânulo. Também é importante projetar controles positivos para calibrar suas medições. Também usamos essa técnica para estudar populações in vitro de bactérias em placas de 96 poços, o que nos permite estudar comunidades mistas de bactérias.
Esta técnica permite abordagens de triagem de alto rendimento para medir a colonização intestinal, bem como a variação biológica na colonização.
