Подсчет колониеобразующих единиц, или КОЕ, является стандартным методом в микробиологии, но он медленный и требует много агаровых пластин. Наша методика обеспечивает стократное преимущество перед традиционными методами подсчета КОЕ в обеих пластинах агарового времени. Мы применили методологию для измерения кишечного микробиома моделей мелких животных, особенно плодовых мушек.
Этот протокол представляет собой простой, быстрый и автоматизированный способ количественной оценки КОЕ у гнотобиотических мух. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс с приборами DIY для фотографирования КОЕ и пользовательским программным обеспечением для автоматизации их подсчета. Этот протокол может быть использован в любом микробиологическом эксперименте, где могут быть полезны более эффективные методы покрытия и подсчета КОЕ.
Эффективное обращение с мухами и обнаружение пластин требует ручной ловкости, поэтому это следует практиковать. Использование автоматизированного программного обеспечения для подсчета требует суждения о пороге, поэтому квитанции следует сравнивать с ручными подсчетами, чтобы определить лучшие параметры для вашего эксперимента Демонстрацией процедуры будет Рен Додж, исследователь из моей лаборатории, который разработал технику. Для начала вылейте 0,5-микронные стеклянные бусины на лоток для измерения шариков.
Разложите бусины на подносе так, чтобы все колодцы были заполнены и выровнены. Затем смахните лишние бусины в коническую трубку. Теперь поместите полуголовую ПЦР-пластину вверх ногами на измерительный лоток и выровняйте ее с колодцами, установив ее в углубление на измерительном лотке.
Затем быстро переверните его, чтобы перенести бусины. Удалите лишние шарики с поверхности ПЦР-пластины. Убедитесь, что все колодцы содержат бусины.
При необходимости используйте весовой совок, чтобы добавить бусины в один колодец. Затем накройте пластину алюминиевой фольгой и автоклавом. Перед использованием пластины добавьте 100 микролитров PBS в каждую скважину непосредственно перед добавлением мух с помощью 96-канального пипетки.
Для поверхностной стерилизации обезболенных мух переложите мух из флакона в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с помощью небольшой воронки. Немедленно распылите один миллилитр 70% этанола в трубку, закройте трубку и перемешайте путем инверсии в течение 10 секунд. Затем аспирируйте этанол пипеткой P-1000, избегая аспирации мух.
После окончательной промывки PBS закройте трубку и несколько раз сильно постучите по скамейке крышкой вниз, чтобы мухи заходили в крышку. После вскрытия трубки дозируйте мухи в колодцы с помощью щипцов и поместите по одной мухе в каждый колодец. Держите мух обезболенными, держа пластину на льду во время погрузки.
Удалите блуждающие шарики рядом с колодцами, так как они могут сломать уплотнение фольги и вызвать утечку. Убедитесь, что тусклая сторона уплотнительной пленки ориентирована вниз на пластину, а блестящая сторона обращена вверх к термоуплотнительному герметику. Плотно прижмите термоуплотнитель в течение пяти секунд и прижмите его ручным аппликатором, чтобы закрепить фольгу.
Гомогенизируйте мух в течение пяти минут. Убедитесь, что мухи полностью гомогенизированы, а раствор окрашивается. Чтобы удалить жидкость из уплотнительной фольги, открутите шариковую пластину в течение 30 секунд в мини-пластинчатом спиннере при 350 г. Снимите фольгу, удерживая пластину, чтобы избежать разбрызгивания капель гомогената мухи.
Поместите три прямоугольные пластины для роста агара MRS с открытыми крышками в шкаф биобезопасности, чтобы высохнуть в течение не менее 10 минут. Подготовьте две разбавляющие пластины, добавив 100 микролитров PBS в каждую скважину стерильной 96-луночной пластины с помощью 96-канального пипетки. Загрузите стойку наконечников-20 на 96-канальный пипетку.
Сделайте разбавление 1:10 путем аспирации 11,1 микролитра гомогената из пробной пластины. Теперь дозируйте его в первую разбавляющую пластину, содержащую 100 микролитров стерильного PBS на лунку. Держите разбавляющую пластину на шейкере пластины в течение 10 секунд при 600 об/мин.
Перемешайте снова, пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз. Переместите 11,1 микролитра с первой разбавляющей пластины на вторую разбавляющую пластину и повторите этапы смешивания для любых дальнейших разбавлений. Для пятнистых плит загрузите два микролитра из каждой скважины в 96-канальный пипетку.
Медленно опустите головку пипетки на тарелку, избегая попадания в агар, и убедитесь, что все пятна были распределены. Затем убедитесь, что жидкие пятна быстро впитываются в агар и не сбегают вместе. Повторите процесс нанесения покрытия на оставшиеся разбавляющие пластины, как описано в рукописи.
Как только жидкость полностью впитается в агар, переверните пластины и высиживайте их, пока колонии не достигнут оптимального размера. Организуйте пластины логически и держите их в определенном порядке во время фотографирования. Ориентируйте их так, чтобы A1 находился в левом верхнем углу для всех тарелок.
Сняв крышку пластины, поместите пластину на сцену с ориентацией формата А1 в правильном углу. Создайте изображение пластин. Перенесите изображения на компьютер и переименуйте их, включая название эксперимента, тип носителя, коэффициент разбавления и другие соответствующие сведения.
Организуйте изображения, подлежащие обработке для количественной оценки, в папку. Имена файлов, которые отличают пластины, становятся заголовками столбцов для каждого набора счетчиков в выходной электронной таблице. Создайте вложенные папки с именами «Обрезанные» и «Квитанции» в папке.
Эти папки получат выходные файлы. Теперь запустите плагин Croptacular из ImageJ и нажмите OK, чтобы начать обрезку. Появится диалоговое окно для выбора исходной папки.
Нажмите кнопку ОК. Выберите исходную папку и нажмите кнопку Открыть. Затем нажмите кнопку ОК в диалоговом окне для выбора целевого каталога. Выберите папку назначения и нажмите кнопку Открыть.
Если изображение уже прямое, просто нажмите клавишу Пробел. В противном случае выпрямите изображение, проведя линию вдоль края, который должен стать горизонтальным. Перерисуйте линию столько раз, сколько необходимо, если изображение не выглядит прямым.
Затем нарисуйте граничное поле для области подсчета и отрегулируйте ее размер и пропорции, пока все пятна не окажутся в их ячейках. Перетащите курсор за пределы поля границы, чтобы обновить сетку. Когда сетка выглядит хорошо, нажмите клавишу Пробел.
Поскольку плагин предполагает, что все фотографии выровнены одинаково, убедитесь, что следующее изображение автоматически поворачивается под тем же углом, что и первое. Если это так, нажмите клавишу Пробел, чтобы продолжить. В противном случае выпрямите изображение, как и раньше.
Сетка также напоминает то же положение, что и предыдущее изображение. При необходимости отрегулируйте и нажмите пробел. Запустите Count-On-It и выберите Gridiron.
Установите пороговую интенсивность колонии на основе верхнего и нижнего значения интенсивности пикселей. Сделайте порог максимально строгим, при этом еще отобрав все колонии. Нажмите кнопку ОК в диалоговом окне Требуется действие, когда пороговое значение будет удовлетворительным, затем нажмите кнопку ОК, чтобы продолжить.
На первом изображении предоставляется опция для продолжения или возврата в меню настройки. Чтобы продолжить пакетный процесс, нажмите кнопку ОК. Затем выберите папку, в которой будут храниться квитанции и таблица результатов. Используйте папку «Квитанции», созданную ранее.
После первого изображения следующие изображения по умолчанию будут иметь то же пороговое значение, что и предыдущие настройки. Нажмите кнопку ОК, чтобы использовать эти параметры или настроить их. Просмотрите квитанции о подсчете, созданные программным обеспечением, и вручную исправьте все ошибки подсчета.
Плагин ImageJ статистически точен, но ошибки случаются. Доказательство квитанций, чтобы изучить выбросы и выявить просчеты. Программа сохраняет данные CFU в виде CSV-файла в той же папке, что и квитанции.
Для мух, колонизированных Lactobacillus plantarum, наблюдалось значительное снижение бактерий у мух, которые либо ежедневно переносились на стерильную пищу, переносились ежедневно, содержались на стерильной пище за четыре часа до анализа, либо переносились ежедневно и содержались на стерильном агаре за четыре часа до анализа по сравнению с мухами, которые никогда не переводились на стерильную пищу после посева. Аналогичные результаты наблюдались у мух, которых кормили Acetobacter indonesiensis, где перенесенные, посттранслированные и очищенные мухи показали значительное снижение КОЕ, но промывка не имела измеримого эффекта, предполагая, что снижение КОЕ было связано с клиренсом бактерий из кишечника, а не из кутикулы. Количество КОЕ в пятнах от 2 до 25 колоний на пятно не показало никакой разницы по сравнению с традиционным методом.
Пятна, в среднем состоящие из 35 колоний, показали более низкие КОЕ, чем контрольные пластины спреда. Это сокращение может быть связано с колониями, перекрывающимися в плотных пятнах. На фотографиях пластин интенсивность колонии была на 300% выше, чем на заднем плане.
Lactobacillus plantarum mCherry-положительные колонии показали на 1000% более высокую интенсивность красного цвета, чем mCherry-отрицательные колонии. Acetobacter indonesiensis GFP-положительные колонии показали на 200% более высокую интенсивность зеленого цвета, чем GFP-отрицательные колонии. Плагин Count-On-It для ImageJ автоматизирует подсчет КОЕ по фотографиям пластин.
Колонии точно обнаруживаются, с сопоставимыми подсчетами с ручным подсчетом. Квитанции о подсчете могут использоваться для выявления просчетов. Изменение пороговых значений размера и длин волн флуоресценции позволяет подсчитывать различные морфологии колоний отдельно.
Важно убедиться, что пластина хорошо запечатана перед бисером. Также важно разработать положительные элементы управления для калибровки измерений. Мы также используем этот метод для изучения популяций бактерий in vitro в 96-луночных пластинах, что позволяет нам изучать смешанные сообщества бактерий.
Этот метод позволяет использовать высокопроизводительные подходы к скринингу для измерения колонизации кишечника, а также биологических вариаций в колонизации.
