El conteo de unidades formadoras de colonias, o UFC, es una técnica estándar en microbiología, pero es lenta y requiere muchas placas de agar. Nuestra técnica proporciona una ventaja de cien veces sobre los métodos tradicionales de conteo de UFC en ambas placas de agar de tiempo. Hemos aplicado la metodología para medir el microbioma intestinal de modelos de animales pequeños, particularmente moscas de la fruta.
Este protocolo es una forma simple, rápida y automatizada de cuantificar las UFC en moscas gnotobióticas. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo con instrumentación fabricada por bricolaje para fotografiar las CFU y software personalizado para automatizar su conteo. Este protocolo podría usarse en cualquier experimento de microbiología donde los métodos más eficientes de recubrimiento y conteo de UFC podrían ser útiles.
Manejar las moscas de manera eficiente y detectar las placas requiere destreza manual, por lo que esto debe practicarse. El uso del software de conteo automatizado requiere un juicio sobre el umbral, por lo que los recibos deben compararse con los recuentos manuales para identificar los mejores parámetros para su experimento. Para comenzar, vierta perlas de vidrio de 0,5 micras en la bandeja de medición de cuentas.
Extienda las cuentas en la bandeja para que todos los pozos estén llenos y nivelados. Luego, cepille el exceso de cuentas en un tubo cónico. Ahora, coloque una placa de PCR semifalda boca abajo en la bandeja de medición y alinéela con los pocillos encajándola en la hendidura de la bandeja de medición.
Luego, voltéelo rápidamente para transferir las cuentas. Retire el exceso de perlas de la superficie de la placa de PCR. Asegúrese de que todos los pozos contengan cuentas.
Si es necesario, use una cuchara de pesaje para agregar cuentas a un solo pozo. Luego, cubra la placa con papel de aluminio y autoclave. Antes de usar la placa, agregue 100 microlitros de PBS a cada pocillo inmediatamente antes de agregar las moscas usando el pipeter de 96 canales.
Para esterilizar la superficie de las moscas anestesiadas, transfiera las moscas del vial a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando un pequeño embudo. Rocíe inmediatamente un mililitro de etanol al 70% en el tubo, cierre el tubo y mezcle por inversión durante 10 segundos. Luego, aspire el etanol con una pipeta P-1000 evitando aspirar moscas.
Después del lavado final de PBS, cierre el tubo y golpee con fuerza en el banco varias veces con la tapa hacia abajo para que las moscas entren en la tapa. Después de abrir el tubo, dispense moscas en los pozos usando fórceps y coloque una mosca en cada pozo. Mantenga las moscas anestesiadas manteniendo el plato en hielo mientras se carga.
Retire las perlas perdidas cerca de los pozos, ya que pueden romper el sello de la lámina y causar fugas. Asegúrese de que el lado opaco de la lámina de sellado esté orientado hacia abajo en la placa y el lado brillante mire hacia el sellador térmico. Presione firmemente el sellador térmico durante cinco segundos y bruñir con el aplicador manual para asegurar la lámina.
Homogeneizar las moscas durante cinco minutos. Asegúrese de que las moscas estén completamente homogeneizadas y que la solución se vuelva coloreada. Para eliminar el líquido de la lámina de sellado, gire hacia abajo la placa de talón durante 30 segundos en un mini spinner de placas a 350 G.Retire la lámina mientras sostiene la placa para evitar salpicaduras de gotas de homogeneizado de mosca.
Coloque tres placas rectangulares de cultivo de agar MRS con sus tapas abiertas en el gabinete de bioseguridad para que se sequen durante al menos 10 minutos. Prepare dos placas de dilución agregando 100 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos usando un pipeter de 96 canales. Cargue un bastidor de puntas P-20 en el pipeter de 96 canales.
Haga una dilución 1:10 aspirando 11.1 microlitros de homogeneizado de la placa de muestra. Ahora, dispense en la primera placa de dilución que contiene 100 microlitros de PBS estéril por pozo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.
Mezclar de nuevo pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Transfiera 11,1 microlitros de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para cualquier dilución adicional. Para las placas de manchado, cargue dos microlitros de cada pocillo en el pipeter de 96 canales.
Baje la cabeza del pipeter lentamente sobre el plato, evitando apuñalar el agar, y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas. Luego, verifique que las manchas líquidas penetren rápidamente en el agar y no corran juntas. Repita el proceso de recubrimiento para las placas de dilución restantes como se describe en el manuscrito.
Una vez que el líquido haya sido completamente absorbido por el agar, invertir las placas e incubarlas hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo. Organiza las placas lógicamente y mantenlas en un orden específico mientras fotografías. Orientarlos de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda para todas las placas.
Después de quitar la tapa de la placa, coloque la placa en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. Imagen de las placas. Transfiera las imágenes a un equipo y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y otros detalles pertinentes.
Organice las imágenes que se procesarán para su cuantificación en una carpeta. Los nombres de archivo que distinguen las placas se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos en la hoja de cálculo de salida. Cree las subcarpetas denominadas Recortado y Recibos en la carpeta.
Estas carpetas recibirán los archivos de salida. Ahora inicie el complemento Croptacular desde ImageJ y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar. Aparecerá un cuadro de diálogo para elegir la carpeta de origen.
Haga clic en Aceptar. Seleccione la carpeta de origen y haga clic en Abrir. A continuación, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo para elegir el directorio de destino. Seleccione la carpeta de destino y pulse Abrir.
Si la imagen ya está recta, simplemente presione Espacio. De lo contrario, endereza la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debería volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen no aparece recta.
A continuación, dibuje un cuadro límite para el área de conteo y ajuste su tamaño y proporción hasta que todos los puntos estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de límite para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.
Dado que el complemento asume que todas las fotos están alineadas de manera idéntica, asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera. Si esto es correcto, presione Espacio para continuar. De lo contrario, endereza la imagen como antes.
La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior. Ajuste si es necesario y pulse Espacio. Inicie Count-On-It y seleccione Gridiron.
Establezca la intensidad de la colonia umbral en función de un valor de intensidad de píxeles superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible, mientras se seleccionan todas las colonias. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo Acción requerida cuando el umbral sea satisfactorio y, a continuación, haga clic en Aceptar para continuar.
En la primera imagen, se da la opción de continuar o volver al menú de configuración. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta Recibos creada anteriormente.
Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán de forma predeterminada el mismo umbral que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para utilizar esta configuración o ajustarla. Revise los recibos de recuento producidos por el software y corrija manualmente cualquier error de conteo.
El complemento ImageJ es estadísticamente preciso, pero se producen errores. Pruebe los recibos para examinar los valores atípicos e identificar los errores de conteo. El software guarda los datos de CFU como un archivo CSV en la misma carpeta que los recibos.
Para las moscas colonizadas con Lactobacillus plantarum, hubo una disminución significativa en las bacterias para las moscas que se transfirieron diariamente a alimentos estériles, se transfirieron diariamente, se mantuvieron en alimentos estériles cuatro horas antes del análisis, o se transfirieron diariamente y se mantuvieron en agar estéril cuatro horas antes del análisis en comparación con las moscas que nunca se transfirieron a alimentos estériles después de la inoculación. Se observaron resultados similares en moscas alimentadas con Acetobacter indonesiensis, donde las moscas transferidas, posttransferidas y eliminadas mostraron una reducción significativa en las UFC, pero el lavado no tuvo un efecto medible, lo que sugiere que la reducción de las UFC se debió a la eliminación de bacterias del intestino en lugar de la cutícula. El recuento de UFC en puntos con 2 a 25 colonias por punto no mostró diferencias en comparación con el método tradicional.
Las manchas con un promedio de 35 colonias mostraron UFC más bajas que las placas de propagación de control. Esta reducción podría deberse a que las colonias se superponen en lugares densos. En las fotos de la placa, la intensidad de la colonia fue un 300% mayor que el fondo.
Las colonias positivas para mCherry de Lactobacillus plantarum mostraron una intensidad roja 1.000% mayor que las colonias mCherry-negativas. Las colonias positivas para GFP de Acetobacter indonesiensis mostraron una intensidad verde 200% mayor que las colonias negativas para GFP. El complemento Count-On-It para ImageJ automatiza el conteo de CFU a partir de las fotos de la placa.
Las colonias se detectan con precisión, con recuentos comparables al conteo manual. Los recibos de recuento se pueden usar para identificar conteos erróneos. El cambio de umbrales de tamaño y longitudes de onda de fluorescencia permite contar diferentes morfologías de colonias por separado.
Es esencial asegurarse de que la placa esté bien sellada antes de que se cuenten las cuentas. También es importante diseñar controles positivos para calibrar sus mediciones. También utilizamos esta técnica para estudiar poblaciones in vitro de bacterias en placas de 96 pocillos, lo que nos permite estudiar comunidades mixtas de bacterias.
Esta técnica permite enfoques de detección de alto rendimiento para medir la colonización intestinal, así como la variación biológica en la colonización.
