Caspases هي بروتياز السيستين التي تشق ركائز أثناء موت الخلايا المبرمج والعمليات غير المبرمجة. يصف هذا البروتوكول مقايسة الانقسام في المختبر لتحديد الركائز المفترضة للبادئ كاسباس درونك من ذبابة الفاكهة. إذا تم اتباع هذا البروتوكول بعناية ، فإنه يوفر إجراء موثوقا به للفحص عالي الإنتاجية للركائز المفترضة من caspase Dronc ، أو أي caspase آخر.
في حين تم تصميم هذا البروتوكول لمقايسات الانقسام في المختبر باستخدام ذبابة الفاكهة كاسباز درونك ، يمكن تكييفه بسهولة مع كاسباز من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك الثدييات. من المهم أن يتم إجراء تنقية الكاسباز المؤتلف ومقايسات الانقسام في المختبر في نفس اليوم لأن هذه المستحضرات كاسباز تفقد النشاط الأنزيمي بسرعة. سيوضح الإجراء الدكتور براثيبها ياريكيباتي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.
للبدء ، قم بإزالة الأنابيب المجمدة مع الثقافات الحبيبية من تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ بها على الجليد لمدة 10 دقائق لتليين الحبيبات. بعد 10 دقائق ، أضف 0.6 ملليلتر من محلول تحلل الخلايا البكتيرية المكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني المضافة حديثا ، و 10 ملليغرام لكل ملليلتر من الليزوزيم ، و 50 وحدة لكل ملليلتر من البنزوناز ، في الأنابيب المحتوية على الحبيبات باستخدام وحدة تحكم ماصة مع ماصة مصلية ملليلتر واحد. باستخدام نفس طرف الماصة ، قم بإذابة الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حتى يصبح المحلول الأصفر الباهت الصافي ، بدون أي جزيئات حبيبات ، مرئيا ويحتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد.
نقل المحللات إلى أنابيب الطرد المركزي المناسبة والطرد المركزي لهم في 17،000 غرام لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المواد الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، وهو المستخلص الخام الذي يحتوي على الكاسباس ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد. أضف 0.2 ملليلتر من ملاط 50٪ من أغاروز حمض النيتريلوسيتيك إلى كل أنبوب من مستخلصات الكاسباز ، وقم بتدوير الأنابيب على دوار من طرف إلى طرف لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
بعد ساعة واحدة ، أضف المستخلص مع أغاروز حمض النيتريلوسيتيك إلى أعمدة بولي بروبيلين ملليلتر مع طرف سليم ، وضعه في رف ، واتركه لمدة خمس دقائق للسماح لأغاروز حمض النيتريلوسيتيك بالاستقرار. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة غطاء الأعمدة ، واترك المادة الطافية تتدفق عن طريق تدفق الجاذبية. ثم أضف بعناية ملليلتر واحد من مخزن الغسيل المؤقت إلى الأعمدة دون إزعاج الراتنج المعبأ لحمض النيكل نيتريلوسيتيك ، واغسله من خلال تدفق الجاذبية.
لشطف الكاسباس ، ضع أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر تحت فوهة تجميع الأعمدة ، بعد التصريف الكامل للمخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، أضف 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للشطف إلى كل عمود واجمع المحلول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. الحفاظ على eluants على الجليد وقياس تركيز البروتينات عن طريق مقايسة برادفورد.
اعتمادا على مستوى التعبير عن الركيزة المفترضة ، استخدم 1 إلى 10 ميكرولتر من محللة أرنب شبكية مبرمجة مع البروتين محل الاهتمام في مقايسة الانقسام واحتفظ بها على الجليد. أضف 10 ميكروغرام من بروتين كاسباز المنقى الذي تم إنشاؤه مسبقا ، وارفع إجمالي حجم التفاعل إلى 50 ميكرولتر باستخدام محلول مقايسة الكاسباز. احتضان التفاعلات في حمام مائي عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، مع التأكد من تضمين الضوابط المناسبة في فحص الانقسام.
بعد ثلاث ساعات ، أوقف التفاعلات عن طريق نقل الأنابيب على الجليد ، وأضف حجما واحدا من المخزن المؤقت لعينة LDS الذي يحتوي على 50 ملليمولار DTT. احتضان العينات عند 75 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة 10 دقائق. قم بالدوران بسرعة ، واخلطها عن طريق النقر ، وقم بتحميل 24 ميكرولترا لكل عينة وقم بتشغيل صفحة SDS أو قم بتخزين العينات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
تم تحفيز أربعة كاسباسات مختلفة مؤتلفة وتنقيتها وتحليلها بواسطة SDS-PAGE ، مناعيا ، وتم فحص اللطخة بجسم مضاد للهستيدين . يعمل 6x-Histidine Dronc غير المعالج بوزن جزيئي نسبي يبلغ 55 كيلودالتون و 6x-His DRICE غير المعالج له وزن جزيئي يبلغ 35 كيلودالتون. يمكن رؤية المعالجة التلقائية للكاسباس من خلال ظهور نطاقات ذات وزن جزيئي أصغر.
بالنسبة لدرونك المشقوق ، فهو عبارة عن شريط من 40 كيلودالتون. بالنسبة للدريس المشقوق ، فهو عبارة عن شريط من 23 كيلودالتون. بعد تفاعل الانقسام في المختبر ، تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE ، المناعية ، وتم تحضين البقع بجسم مضاد مضاد ل Myc للكشف عن الخلايا الأمينية الموسومة ب Myc Drice C211A.
أظهرت النتائج أن المستحضر البري 6x-histidine Dronc المنتج والمنقى بكتيريا له نشاط إنزيمي. يمكن رؤية ذلك من خلال وجود شريط أصغر من Drice المشقوق مقارنة ب proDrice غير المشقوقة. تم تحليل تفاعل الانقسام في المختبر الذي يستخدم كلا من caspase المؤتلف والركيزة بواسطة SDS-PAGE و immunoblot.
لتحليل تفاعل الانقسام ، تم استخدام الجسم المضاد ل Drice المشقوق في هذه البقعة المناعية. أظهرت النتائج أن مستحضر 6x-His Dronc المنتج والمنقى بكتيريا له نشاط إنزيمي. يمكن رؤية ذلك من خلال وجود شريط أصغر من Drice المشقوق مقارنة ب proDrice غير المشقوق.
يرجى تذكر أن الكاسباس المؤتلف يفقد النشاط الأنزيمي بسرعة. لا يمكن تخزينها ، ولا حتى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. يجب إجراء فحوصات الانقسام في المختبر في نفس اليوم.
يجب التحقق من صحة النتائج الإيجابية في فحص الانقسام في المختبر في الجسم الحي. يمكن القيام بذلك في الخلايا أو في الكائنات الحية النموذجية الوراثية مثل ذبابة الفاكهة أو C.elegans.
