カスパーゼは、アポトーシスおよび非アポトーシスプロセス中に基質を切断するシステインプロテアーゼです。このプロトコルは、ショウジョウバエ由来の開始カスパーゼDroncの推定基質を同定するためのインビトロ切断アッセイを記載している。注意深く従えば、このプロトコルは、カスパーゼDroncまたは他のカスパーゼの推定基質のハイスループットスクリーニングのための信頼できる手順を提供します。
このプロトコルは、ショウジョウバエカスパーゼDroncを使用したin vitro切断アッセイ用に設計されていますが、哺乳類を含む他の生物からのカスパーゼにも簡単に適合させることができます。組換えカスパーゼの精製とin vitro切断アッセイは、これらのカスパーゼ調製物が酵素活性を急速に失うため、同じ日に実施することが重要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるプラティバ・ヤリキパティ博士です。
まず、マイナス80°Cの貯蔵庫からペレット培養物を入れた凍結チューブを取り出し、氷上に10分間保持してペレットを柔らかくします。10分後、1ミリリットルの血清学的ピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤、リゾチーム1ミリリットルあたり10ミリグラム、およびベンゾナーゼ1ミリリットルあたり50単位を添加した0.6ミリリットルの細菌細胞溶解バッファーをペレット含有チューブに加えます。同じピペットチップで、ペレット粒子のない透明で淡黄色の溶液が見えるまで上下にピペッティングしてペレットを溶解し、氷上で30分間インキュベートします。
ライセートを適切な遠心チューブに移し、摂氏4度で40分間17, 000 Gで遠心分離します。上清をカスパーゼを含む粗抽出物である1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、チューブを氷上に置きます。カスパーゼ抽出物の各チューブにニトリロ酢酸アガロースの50%スラリー0.2ミリリットルを加え、摂氏4度で1時間、エンドオンエンドローテーター上でチューブを回転させます。
1時間後、Ni-ニトリロ酢酸アガロースを含む抽出物を、先端をそのままにして1ミリリットルのポリプロピレンカラムに加え、ラックに入れ、5分間静置してNi-ニトリロ酢酸アガロースを沈降させます。5分後、カラムのキャップを外し、上澄み液を重力流で流出させます。次に、Ni-ニトリロ酢酸アガロースの充填樹脂を乱すことなく、1ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに慎重に添加し、重力流で洗浄します。
カスパーゼを溶出するには、洗浄バッファーを完全に排出した後、1.5ミリリットルの微量遠心チューブをカラムの収集ノズルの下に置きます。次に、各カラムに0.5ミリリットルの溶出バッファーを加え、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに溶離液を回収します。溶離液を氷上に保ち、ブラッドフォードアッセイでタンパク質の濃度を測定します。
推定基質の発現レベルに応じて、切断アッセイで目的のタンパク質でプログラムされた1〜10マイクロリットルのウサギ網状赤血球ライセートを使用し、氷上に保ちます。以前に生成した精製カスパーゼタンパク質を10マイクログラム加え、カスパーゼアッセイバッファーで総反応量を50マイクロリットルにします。反応物を摂氏30度のウォーターバスで3時間インキュベートし、切断アッセイに適切なコントロールが含まれるようにします。
3時間後、チューブを氷上に移して反応を停止し、50ミリモルDTTを含むLDSサンプルバッファーを1容量加えます。サンプルをヒートブロックで摂氏75度で10分間インキュベートします。すばやく回転し、フリックして混合し、サンプルあたり24マイクロリットルをロードし、SDSページを実行するか、サンプルを摂氏マイナス20度で保管します。
4つの異なる組換えカスパーゼを誘導し、精製し、SDS-PAGEで分析し、イムノブロットし、ブロットを抗ヒスチジン抗体でプローブしました。未処理の6x-ヒスチジンDroncは55キロダルトンの相対分子量で動作し、未処理の6x-HisDRYEの分子量は35キロダルトンです。カスパーゼの自動処理は、より小さな分子量のバンドの出現によって見える。
切断されたドロンクの場合、それは40キロダルトンのバンドです。劈開されたドリスの場合、それは23キロダルトンのバンドです。in vitro切断反応後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、イムノブロットし、ブロットを抗Myc抗体とともにインキュベートして、アミノ末端MycタグDrice C211Aを検出しました。
結果は、細菌で生産および精製された6x-ヒスチジンDronc野生型製剤が酵素活性を有することを実証した。これは、切断されたプロドリスと比較して、切断されたドライスのバンドが小さいことによって明らかになります。組換えカスパーゼと基質の両方を使用するin vitro切断反応をSDS-PAGEとイムノブロットで分析しました。
切断反応の分析のために、抗切断Drice抗体をこのイムノブロットに使用した。結果は、細菌で生産および精製された6x-HisDronc調製物が酵素活性を有することを実証した。これは、切断されたプロドリスと比較して、切断されたドライスのバンドが小さいことによって明らかになります。
組換えカスパーゼは酵素活性を急速に失うことを忘れないでください。マイナス80°Cでも保管できません。インビトロ切断アッセイは、同じ日に実施する必要があります。
in vitro切断アッセイにおける陽性ヒットは、in vivoで検証する必要があります。これは、細胞またはショウジョウバエやC.エレガンスなどの遺伝子モデル生物で行うことができます。
