Les caspases sont des protéases cystéines qui clivent les substrats pendant l’apoptose et les processus non apoptotiques. Ce protocole décrit un test de clivage in vitro pour identifier les substrats putatifs de la caspase initiatrice Dronc de la drosophile. S’il est suivi attentivement, ce protocole fournit une procédure fiable pour le criblage à haut débit des substrats putatifs de la caspase Dronc, ou de toute autre caspase.
Bien que ce protocole ait été conçu pour les tests de clivage in vitro utilisant la caspase Dronc de la drosophile, il peut facilement être adapté aux caspases d’autres organismes, y compris les mammifères. Il est important que la purification des caspases recombinantes et les essais de clivage in vitro soient effectués le même jour car ces préparations de caspases perdent rapidement leur activité enzymatique. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Prathibha Yarikipati, boursier postdoctoral de mon laboratoire.
Pour commencer, retirez les tubes congelés avec les cultures granulées de moins 80 degrés Celsius et conservez-les sur la glace pendant 10 minutes pour ramollir le granulé. Après 10 minutes, ajoutez 0,6 millilitre de tampon de lyse cellulaire bactérienne complété par des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés, 10 milligrammes par millilitre de lysozyme et 50 unités par millilitre de benzonase, dans les tubes contenant la pastille à l’aide d’un contrôleur de pipette avec une pipette sérologique d’un millilitre. Avec la même pointe de pipette, dissoudre la pastille en pipetant de haut en bas jusqu’à ce qu’une solution limpide, jaune pâle, sans aucune particule de pastille, soit visible et incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
Transférer les lysats dans des tubes de centrifugation appropriés et les centrifuger à 17 000 g pendant 40 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez les surnageants dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, qui est l’extrait brut contenant les caspases, et gardez les tubes sur de la glace. Ajouter 0,2 millilitre de la suspension à 50% d’acide ni-nitriloacétique agarose à chaque tube des extraits de caspase, et faire tourner les tubes sur un rotateur de bout en bout pendant une heure à 4 degrés Celsius.
Après une heure, ajoutez l’extrait avec l’agarose d’acide nitriloacétique Ni-nitriloacétique à des colonnes de polypropylène d’un millilitre avec une pointe intacte, placée dans une grille, et laissez-le reposer pendant cinq minutes pour permettre à l’agarose à l’acide nitriloacétique de se déposer. Après cinq minutes, retirez le bouchon des colonnes et laissez le surnageant s’écouler par gravité. Ensuite, ajoutez soigneusement un millilitre de tampon de lavage aux colonnes sans perturber la résine emballée d’agarose d’acide nitriloacétique et lavez-la par gravité.
Pour l’élution des caspases, placez des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre sous la buse collectrice des colonnes, après vidange complète du tampon de lavage. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon d’élution à chaque colonne et recueillez l’éluant dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Gardez les éluants sur la glace et mesurez la concentration de protéines par le test de Bradford.
Selon le niveau d’expression du substrat putatif, utiliser 1 à 10 microlitres du lysat de réticulocytes de lapin programmé avec la protéine d’intérêt dans le test de clivage et le garder sur la glace. Ajouter 10 microgrammes de protéine de caspase purifiée générée précédemment et porter le volume total de réaction à 50 microlitres avec un tampon de dosage de caspases. Incuber les réactions dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant trois heures, en veillant à inclure les témoins appropriés dans le test de clivage.
Après trois heures, arrêtez les réactions en transférant les tubes sur de la glace et ajoutez un volume de tampon d’échantillon LDS contenant 50 millimolaires de DTT. Incuber les échantillons à 75 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant 10 minutes. Tournez rapidement, mélangez par effleurement, chargez 24 microlitres par échantillon et exécutez la page SDS ou stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius.
Quatre caspases recombinantes différentes ont été induites, purifiées et analysées par SDS-PAGE, immunoblottées, et le transfert a été sondé avec un anticorps antihistidine. Le 6x-Histidine Dronc non transformé fonctionne à un poids moléculaire relatif de 55 kilodalton et le 6x-His DRICE non transformé a un poids moléculaire de 35 kilodalton. Le traitement automatique des caspases est visible par l’apparition de bandes de plus petit poids moléculaire.
Pour le Dric clivé, il s’agit d’une bande de 40 kilodaltons. Pour le Drice clivé, il s’agit d’une bande de 23 kilodaltons. Après la réaction de clivage in vitro, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, immunoblottées, et les blots ont été incubés avec un anticorps anti-Myc pour détecter le Drice C211A marqué par Myc en phase terminale.
Les résultats ont démontré que la préparation de type sauvage 6x-histidine Dronc produite par des bactéries et purifiée a une activité enzymatique. Ceci est visible par la présence de la plus petite bande de Drice clivé par rapport à l’oncle proDrice. La réaction de clivage in vitro qui utilise à la fois de la caspase recombinante et du substrat a été analysée par SDS-PAGE et immunoblot.
Pour l’analyse de la réaction de clivage, l’anticorps anti-clivage de Drice a été utilisé dans ce transfert immunologique. Les résultats ont démontré que la préparation 6x-His Dronc produite et purifiée par des bactéries a une activité enzymatique. Ceci est visible par la présence de la plus petite bande de Drice clivé par rapport au proDrice onculé.
N’oubliez pas que les caspases recombinantes perdent rapidement leur activité enzymatique. Ils ne peuvent pas être stockés, même pas à moins 80 degrés Celsius. Les essais de clivage in vitro doivent être effectués le même jour.
Les résultats positifs obtenus dans l’essai de clivage in vitro doivent être validés in vivo. Cela peut être fait dans des cellules ou dans des organismes modèles génétiques tels que Drosophila ou C.elegans.
