Caspasen sind Cysteinproteasen, die Substrate während der Apoptose und nicht-apoptotischer Prozesse spalten. Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Spaltungsassay zur Identifizierung mutmaßlicher Substrate des Initiators Caspase Dronc aus Drosophila. Bei sorgfältiger Befolgung bietet dieses Protokoll ein zuverlässiges Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening von mutmaßlichen Substraten der Caspase Dronc oder einer anderen Caspase.
Obwohl dieses Protokoll für In-vitro-Spaltungstests mit Drosophila caspase Dronc entwickelt wurde, kann es leicht für Caspasen anderer Organismen, einschließlich Säugetiere, angepasst werden. Es ist wichtig, dass die Reinigung der rekombinanten Caspasen und die In-vitro-Spaltungstests noch am selben Tag durchgeführt werden, da diese Caspase-Präparate schnell an enzymatischer Aktivität verlieren. Das Verfahren wird Dr. Prathibha Yarikipati, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.
Um zu beginnen, entfernen Sie die gefrorenen Röhrchen mit den pelletierten Kulturen aus der Lagerung von minus 80 Grad Celsius und halten Sie sie 10 Minuten auf Eis, um das Pellet weich zu machen. Nach 10 Minuten 0,6 Milliliter bakterieller Zelllysepuffer, ergänzt mit frisch hinzugefügten Proteaseinhibitoren, 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym und 50 Einheiten pro Milliliter Benzonase, in die pellethaltigen Röhrchen mit einem Pipettencontroller mit einer einmilliliter serologischen Pipette geben. Lösen Sie das Pellet mit derselben Pipettenspitze auf, indem Sie auf und ab pipettieren, bis eine klare, hellgelbe Lösung ohne Pelletpartikel sichtbar ist, und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.
Lysate in geeignete Zentrifugenröhrchen überführen und bei 17.000 G für 40 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände werden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das der Rohextrakt ist, der die Caspasen enthält, und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Fügen Sie 0,2 Milliliter der 50% igen Aufschlämmung Ni-Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu jedem Röhrchen der Caspase-Extrakte hinzu und drehen Sie die Röhrchen auf einem End-on-End-Rotator für eine Stunde bei 4 Grad Celsius.
Nach einer Stunde den Extrakt mit der Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu einer Milliliter-Polypropylen-Säule mit intakter Spitze in ein Gestell geben und fünf Minuten stehen lassen, damit sich Ni-Nitrilessigsäure-Agarose absetzen kann. Entfernen Sie nach fünf Minuten die Kappe der Säulen und lassen Sie den Überstand durch Schwerkraft ausströmen. Dann geben Sie vorsichtig einen Milliliter des Waschpuffers zu den Säulen, ohne das verpackte Harz der Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu stören, und waschen Sie es durch den Schwerkraftfluss.
Zur Elution der Caspasen legen Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen unter die Auffangdüse der Säulen, nachdem der Waschpuffer vollständig entleert wurde. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter des Elutionspuffers zu jeder Säule hinzu und sammeln Sie das Elutionsmittel in den 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Elutionsmittel auf Eis und messen Sie die Konzentration der Proteine mit dem Bradford-Assay.
Je nach Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats verwenden Sie 1 bis 10 Mikroliter des Kaninchen-Retikulozyten-Lysats, das mit dem interessierenden Protein im Spalttest programmiert ist, und halten Sie es auf Eis. Fügen Sie 10 Mikrogramm zuvor erzeugtes gereinigtes Caspase-Protein hinzu und bringen Sie das Gesamtreaktionsvolumen mit Caspase-Assay-Puffer auf 50 Mikroliter. Die Reaktionen werden drei Stunden lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius inkubiert, wobei die entsprechenden Kontrollen in den Spaltungstest einbezogen werden.
Nach drei Stunden stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhrchen auf Eis übertragen und ein Volumen LDS-Probenpuffer mit 50 Millimolar DTT hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben bei 75 Grad Celsius in einem Hitzeblock für 10 Minuten. Schnell drehen, durch Flicken mischen, 24 Mikroliter pro Probe laden und die SDS-Seite ausführen oder die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Vier verschiedene rekombinante Caspasen wurden induziert, gereinigt und mittels SDS-PAGE analysiert, immunoblottiert und der Blot mit einem Antihistidin-Antikörper untersucht. Der unverarbeitete 6x-Histidin Dronc läuft mit einem relativen Molekulargewicht von 55 Kilodalton und der unverarbeitete 6x-His DRICE hat ein Molekulargewicht von 35 Kilodalton. Die automatische Verarbeitung der Caspasen ist durch das Auftreten von Bändern mit kleinerem Molekulargewicht sichtbar.
Für gespaltene Dronc ist es ein Band von 40 Kilodalton. Für gespaltenen Drice ist es ein Band von 23 Kilodalton. Nach der In-vitro-Spaltungsreaktion wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt, immunoblottiert und die Blots wurden mit einem Anti-Myc-Antikörper inkubiert, um Amino-terminale Myc-markierte Drice C211A nachzuweisen.
Die Ergebnisse zeigten, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6x-Histidin Dronc Wildtyppräparat enzymatische Aktivität aufweist. Dies ist durch das Vorhandensein des kleineren Bandes von gespaltenem Drossel im Vergleich zu ungespaltenem ProDrice sichtbar. Die in vitro Spaltungsreaktion, die sowohl rekombinante Caspase als auch Substrat verwendet, wurde mittels SDS-PAGE und Immunoblot analysiert.
Zur Analyse der Spaltungsreaktion wurde in diesem Immunoblot der antigespaltene Drice-Antikörper verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6x-His Dronc Präparat enzymatische Aktivität aufweist. Dies ist durch das Vorhandensein des kleineren Bandes von gespaltenem Drice im Vergleich zum ungespaltenen proDrice sichtbar.
Bitte denken Sie daran, dass rekombinante Caspasen schnell an enzymatischer Aktivität verlieren. Sie können nicht gelagert werden, auch nicht bei minus 80 Grad Celsius. Die In-vitro-Spaltungstests müssen am selben Tag durchgeführt werden.
Positive Treffer im In-vitro-Spaltungstest sollten in vivo validiert werden. Dies kann in Zellen oder in genetischen Modellorganismen wie Drosophila oder C.elegans erfolgen.
