Caspases são proteases de cisteína que clivam substratos durante a apoptose e processos não apoptóticos. Este protocolo descreve um ensaio de clivagem in vitro para identificar supostos substratos da caspase iniciadora Dronc de Drosophila. Se seguido cuidadosamente, este protocolo fornece um procedimento confiável para triagem de alto rendimento de substratos putativos da caspase Dronc ou qualquer outra caspase.
Embora este protocolo tenha sido projetado para ensaios de clivagem in vitro usando a Drosophila caspase Dronc, ele pode ser facilmente adaptado para caspases de outros organismos, incluindo mamíferos. É importante que a purificação das caspases recombinantes e os ensaios de clivagem in vitro sejam realizados no mesmo dia, porque essas preparações de caspase perdem atividade enzimática rapidamente. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Prathibha Yarikipati, um pós-doutorando do meu laboratório.
Para começar, remova os tubos congelados com as culturas peletizadas do armazenamento de menos 80 graus Celsius e mantenha-os no gelo por 10 minutos para suavizar o pellet. Após 10 minutos, adicione 0,6 mililitros de tampão de lise de células bacterianas suplementado com inibidores de protease recém-adicionados, 10 miligramas por mililitro de lisozima e 50 unidades por mililitro de Benzonase, no pellet contendo tubos usando um controlador de pipeta com uma pipeta sorológica de um mililitro. Com a mesma ponta da pipeta, dissolva o pellet pipetando para cima e para baixo até que uma solução límpida e amarela pálida, sem partículas de pellets, seja visível e incube por 30 minutos no gelo.
Transfira lisados para tubos de centrífuga apropriados e centrifuja-os a 17.000 G por 40 minutos a 4 graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, que é o extrato bruto que contém as caspases, e mantenha os tubos no gelo. Adicionar 0,2 mililitros da pasta de 50% de agarose de ácido ni-ninitrilacético a cada tubo dos extratos de caspase e girar os tubos em um rotador de ponta a ponta por uma hora a 4 graus Celsius.
Após uma hora, adicione o extracto com a agarose do ácido ni-ninilocacético a colunas de polipropileno de um mililitro com uma ponta intacta, colocado numa cremalheira, e deixe repousar durante cinco minutos para permitir que a agarose do ácido ni-nitriloacético se assente. Após cinco minutos, remova a tampa das colunas e deixe o sobrenadante fluir para fora por gravidade. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro do tampão de lavagem às colunas sem perturbar a resina embalada de acarose do ácido ni-nitrilacético e lave-a através do fluxo de gravidade.
Para a eluição das caspases, colocar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros sob o bocal coletor das colunas, após a drenagem completa do tampão de lavagem. Em seguida, adicione 0,5 mililitros do tampão de eluição a cada coluna e recolha o eluante nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mantenha os eluantes no gelo e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford.
Dependendo do nível de expressão do substrato putativo, use de 1 a 10 microlitros do lisado de reticulócitos de coelho programado com a proteína de interesse no ensaio de clivagem e mantenha-o no gelo. Adicione 10 microgramas de proteína de caspase purificada gerada anteriormente e eleve o volume total de reação para 50 microlitros com tampão de ensaio de caspase. Incubar as reações em banho-maria a 30 graus Celsius durante três horas, garantindo a inclusão dos controlos adequados no ensaio de clivagem.
Após três horas, pare as reações transferindo os tubos no gelo e adicione um volume de tampão de amostra SUD contendo 50 milimolares de TDT. Incubar as amostras a 75 graus Celsius em um bloco de calor por 10 minutos. Gire rapidamente, misture agitando, carregue 24 microlitros por amostra e execute a página SDS ou armazene as amostras a menos 20 graus Celsius.
Quatro caspases recombinantes diferentes foram induzidas, purificadas e analisadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e o blot foi sondado com um anticorpo anti-histidina . O Dronc 6x-Histidine não processado funciona a um peso molecular relativo de 55 kilodalton e o 6x-His DRICE não processado tem um peso molecular de 35 kilodalton. O processamento automático das caspases é visível pelo aparecimento de bandas de menor peso molecular.
Para o Dronc clivado é uma faixa de 40 kilodaltons. Para Drice clivado é uma faixa de 23 kilodalton. Após a reação de clivagem in vitro, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e as manchas foram incubadas com um anticorpo anti-Myc para detectar Drice C211A com marcação amino terminalmente Myc.
Os resultados demonstraram que a preparação do tipo selvagem Dronc 6x-histidina produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática. Isto é visível pela presença da menor faixa de Drice clivada em comparação com a pró-Drice tiado. A reação de clivagem in vitro que utiliza caspase recombinante e substrato foi analisada por SDS-PAGE e immunoblot.
Para a análise da reação de clivagem, o anticorpo Drice clivado foi utilizado neste immunoblot. Os resultados demonstraram que a preparação de Dronc 6x-His produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática. Isto é visível pela presença da menor faixa de Drice clivada em comparação com o tio proDrice.
Lembre-se de que as caspases recombinantes perdem atividade enzimática rapidamente. Eles não podem ser armazenados, nem mesmo a menos 80 graus Celsius. Os ensaios de clivagem in vitro têm de ser realizados no mesmo dia.
Acertos positivos no ensaio de clivagem in vitro devem ser validados in vivo. Isso pode ser feito em células ou em organismos modelo genético, como Drosophila ou C.elegans.
