Le caspasi sono proteasi di cisteina che scindono i substrati durante l'apoptosi e i processi non apoptotici. Questo protocollo descrive un test di scissione in vitro per identificare i substrati putativi dell'iniziatore caspasi Dronc da Drosophila. Se seguito attentamente, questo protocollo fornisce una procedura affidabile per lo screening ad alto rendimento di substrati putativi della caspasi Dronc o di qualsiasi altra caspasi.
Mentre questo protocollo è stato progettato per saggi di scissione in vitro utilizzando la Drosophila caspasi Dronc, può essere facilmente adattato per caspasi di altri organismi, compresi i mammiferi. È importante che la purificazione delle caspasi ricombinanti e i saggi di scissione in vitro vengano eseguiti nello stesso giorno perché questi preparati di caspasi perdono rapidamente l'attività enzimatica. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Prathibha Yarikipati, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.
Per iniziare, rimuovere i tubi congelati con le colture pellettate da meno 80 gradi Celsius e tenerli in ghiaccio per 10 minuti per ammorbidire il pellet. Dopo 10 minuti, aggiungere 0,6 millilitri di tampone di lisi cellulare batterica integrato con inibitori della proteasi appena aggiunti, 10 milligrammi per millilitro di lisozima e 50 unità per millilitro di benzonasi, nei tubi contenenti pellet utilizzando un controller per pipette con una pipetta sierologica da un millilitro. Con la stessa punta della pipetta, sciogliere il pellet mediante pipettaggio su e giù fino a quando una soluzione limpida, giallo pallido, senza particelle di pellet, è visibile e incubare per 30 minuti su ghiaccio.
Trasferire i lisati in apposite provette da centrifuga e centrifugarli a 17.000 G per 40 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri, che è l'estratto grezzo contenente le caspasi, e mantenere i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 0,2 millilitri del 50% di sospensione dell'acido Ni-nitriloacetico agarosio a ciascun tubo degli estratti di caspasi e ruotare i tubi su un rotatore end-on-end per un'ora a 4 gradi Celsius.
Dopo un'ora, aggiungere l'estratto con l'agarosio di acido Ni-nitriloacetico a un millilitro di colonne di polipropilene con una punta intatta, poste in una griglia, e lasciare riposare per cinque minuti per consentire all'acido Ni-nitriloacetico agarosio di depositarsi. Dopo cinque minuti, rimuovere il cappuccio delle colonne e lasciare che il surnatante fluisca fuori per gravità. Quindi aggiungere con attenzione un millilitro del tampone di lavaggio alle colonne senza disturbare la resina imballata di agarosio acido Ni-nitriloacetico e lavarlo attraverso il flusso di gravità.
Per l'eluizione delle caspasi, posizionare i tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri sotto l'ugello di raccolta delle colonne, dopo il completo drenaggio del tampone di lavaggio. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di eluizione a ciascuna colonna e raccogliere l'eluente nelle provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Mantenere gli eluenti sul ghiaccio e misurare la concentrazione di proteine mediante il saggio Bradford.
A seconda del livello di espressione del substrato putativo, utilizzare da 1 a 10 microlitri di lisato reticolocitario di coniglio programmato con la proteina di interesse nel test di scissione e tenerlo sul ghiaccio. Aggiungere 10 microgrammi di proteina di caspasi purificata generata in precedenza e portare il volume totale di reazione a 50 microlitri con tampone di dosaggio della caspasi. Incubare le reazioni a bagnomaria a 30 gradi Celsius per tre ore, assicurandosi di includere i controlli appropriati nel test di scissione.
Dopo tre ore, interrompere le reazioni trasferendo le provette sul ghiaccio e aggiungere un volume di tampone campione LDS contenente 50 millimolari DTT. Incubare i campioni a 75 gradi Celsius in un blocco di calore per 10 minuti. Girare rapidamente, mescolare sfogliando, caricare 24 microlitri per campione ed eseguire la pagina SDS o conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius.
Quattro diverse caspasi ricombinanti sono state indotte, purificate e analizzate da SDS-PAGE, immunoblotted, e la macchia è stata sondata con un anticorpo antistaminico. Il Dronc 6x-Histidine non elaborato ha un peso molecolare relativo di 55 kilodalton e il DRICE 6x-His non elaborato ha un peso molecolare di 35 kilodalton. L'auto-elaborazione delle caspasi è visibile dalla comparsa di bande di peso molecolare più piccolo.
Per Dronc spaccato, è una banda di 40 kilodalton. Per Drice spaccato, è una fascia di 23 kilodalton. Dopo la reazione di scissione in vitro, le proteine sono state separate da SDS-PAGE, immunoblotted, e le macchie sono state incubate con un anticorpo anti-Myc per rilevare l'amminoacido terminale Myc-taggato Drice C211A.
I risultati hanno dimostrato che la preparazione wild-type Dronc 6x-istidina prodotta e purificata battericamente ha attività enzimatica. Ciò è visibile dalla presenza della banda più piccola di Drice spaccato rispetto al proDricio non scisso. La reazione di scissione in vitro che utilizza sia caspasi ricombinante che substrato è stata analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblot.
Per l'analisi della reazione di scissione, in questo immunoblot è stato utilizzato l'anticorpo Drice anti scissione. I risultati hanno dimostrato che la preparazione di Dronc 6x-His prodotta e purificata battericamente ha attività enzimatica. Ciò è visibile dalla presenza della banda più piccola di Drice spaccato rispetto al proDrice non scisso.
Si ricorda che le caspasi ricombinanti perdono rapidamente l'attività enzimatica. Non possono essere conservati, nemmeno a meno 80 gradi Celsius. I test di scissione in vitro devono essere eseguiti lo stesso giorno.
I colpi positivi nel test di clivaggio in vitro devono essere convalidati in vivo. Questo può essere fatto in cellule o in organismi modello genetici come Drosophila o C.elegans.
