يوفر البروتوكول في هذه الدراسة استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 التالفة من نقص الأكسجة ، ومرجع لتحسين أفضل وضع مزيج من الأعشاب. يمكن أن توفر هذه التقنية طريقة تجريبية بسيطة وموثوقة وفعالة في المختبر لفحص تركيبة المكونات الفعالة من الأعشاب ، ضد الخلايا الناقصة. يمكن أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لفحص مجموعات المكونات ضد خلايا نقص الأكسجين من مجموعات تحضير الأعشاب الأخرى ، وتوضيح آلية الحماية الخاصة بها.
للبدء ، قم بزراعة خلايا PC12 الفرعية كل يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة مكملة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ للحصول على ممر من 4 إلى 8 لجميع التجارب اللاحقة. عالج 70 إلى 80٪ من خلايا PC12 المتقاربة بملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين ، وراقب الخلايا تحت المجهر لانفصال الخلايا. ثم أوقف هضم التربسين بإضافة ثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل.
قم بتدوير الخلايا المنقولة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بسرعة 840 × جم لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية بالوسط الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. لحساب الخلايا ، ابدأ برنامج قياس التدفق الخلوي وحدد مضاعف التخفيف المقابل لمحلول الخلية في إعداد العد.
انقر فوق مخطط الكثافة بعد تحميل عينة الخلية. ضع دائرة حول عدد الخلايا بعيدا عن المحور السيني والمحور الصادي. انقر بزر الماوس الأيمن فوق جدول البيانات أسفل الشكل، وحدد X وY وCount وAbs.
عد للحصول على نتائج عد الخلايا ضمن جدول بيانات Abs.Count. بعد ضبط تركيز الخلية تقريبا إلى 1 مرة 10 إلى 5 خلايا لكل مليلتر مع الوسط الكامل ، أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بئر إلى لوحة 96 بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، أضف إلى اللوحة المهملة الطاف 120 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول MTT في كل بئر ، واحتضانها لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، بمجرد التخلص من المادة الطافية ، أضف 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر. حافظ على اللوحة تحت الاهتزاز في مذبذب دوامة لمدة 10 دقائق بسرعة 240 مرة في الدقيقة. ثم قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة.
لفحص التركيبة المثلى من الأدوية بطريقة تصميم متجانسة ، قم بزراعة الخلايا كما هو موضح سابقا وعلاج خلايا PC12 المصابة بستة تركيزات مختلفة من حقن استراغالوس وكبسولة breviscapus. لتقييم التأثير الوقائي لمجموعتين مثاليتين ، عالج خلايا PC12 المصابة بنوعين من الأدوية. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة وحساب صلاحية الخلية كما هو موضح سابقا.
بذر خلايا PC12 في صفيحة من 12 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد العلاج بالعقاقير ، عالج الخلايا ب 250 ميكرولتر من التربسين لكل بئر وطرد الخلايا بالطرد المركزي عند 840 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
أضف 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC ، و 10 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في ثلاث نسخ لكل مجموعة ، واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتحقق من موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي. في برنامج مقياس التدفق الخلوي، انقر فوق التعويض التلقائي في قائمة ابدأ، وحدد FITC وPE وPerCP وAPC في القناة تحديد، وحدد التعويض عند الارتفاع. ثم اضغط OK في العنصر الإحصائي: متوسط.
انقر فوق خريطة الكثافة وقم بوضع دائرة حول عدد الخلايا الفعال باستخدام طريقة عد الخلايا الموضحة سابقا. باستخدام مضان FITC كمعلمة المحور السيني والتألق الآخر كمعلمة المحور الصادي ، قم بإنشاء خريطة كثافة. انقر فوق مصفوفة التعويض في قائمة ابدأ والمعامل في مصفوفة الفائض.
قم بزرع خلايا PC12 على أغطية موضوعة على بئر مكون من 24 بئرا في ثلاث نسخ ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد العلاج بالعقاقير ، اشطف الأغطية مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما ، وقم بإصلاحها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة ، ونفاذها باستخدام 0.5٪ Triton X-100 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الخلايا ، قم بحظرها بمصل الماعز بنسبة 10٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
أضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف caspase-3 إلى كل غطاء واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت TBST لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ، واحتضان 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة ، احتضن أغطية الأغطية ب 300 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق لكل منهما.
التقط صور الغطاء تحت مجهر مضان وحلل إحصائيا شدة التألق باستخدام برنامج التصوير. اغسل غطاء خلية PC12 المعالج بالعقاقير ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة ثلاث دقائق لكل منها واحتضانه ب 400 ميكرولتر من 10 ميكرومولار ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DMEM الخالي من المصل مرتين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما.
أضف عامل التبريد الفلوري والتقط على الفور صور الغطاء تحت مجهر مضان لحساب شدة التألق النسبية باستخدام برنامج التصوير. اغسل خلايا PC12 المعالجة بالعقاقير في صفيحة من 6 آبار ثلاث مرات مع PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة في محلول التحلل المحضر البالغ 100 ميكرولتر لكل بئر. بعد التحلل ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 16،000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع المادة الطافية.
بعد اكتشاف تركيز البروتين بواسطة مقايسة برادفورد ، قم بتشغيل رحلان كهربائي SDS-PAGE بنسبة 12٪ مع 25 ميكروغرام من البروتين في كل حارة ونقل الجل إلى غشاء PVDF. سد الأغشية مع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5 ٪ لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، واحتضان مع خمسة ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية المقابلة لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة وغسل الغشاء مع TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما ، احتضان مع خمسة ملليلتر من الأجسام المضادة الثانوية HRP المترافقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
أخيرا ، إلى الغشاء المغسول TBST ، أضف ركيزة HRP كيميائية مضيئة للكشف عن نطاق البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم التقط الصور باستخدام نظام التصوير الكيميائي لتحديد القيم الرمادية للبروتينات ، مع بيتا أكتين كعنصر تحكم داخلي. كانت صلاحية الخلية على خلايا PC12 العادية أقل من 95٪ مع حقن استراغالوس بتركيزات أكبر من 12 ميكرومولار ، وأكبر من 5 ميكرومولار لكبسولة بريفيسكابوس.
يمكن أن يؤدي حقن استراغالوس إلى تحسين معدل بقاء خلايا PC12 المصابة في نطاق تركيز من 6 إلى 12 ميكرومولار ، وكبسولة breviscapus من 2 إلى 5 ميكرومولار. في حين أن تركيبة الدواء بنسبة 6 إلى 1.8 ميكرومولار أظهرت أعلى قابلية للخلية. تم تعزيز صلاحية الخلية للمجموعتين على خلايا PC12 المصابة بشكل كبير ، وكانت تركيبة المكونات متفوقة على مجموعة التحضير.
أظهر معدل موت الخلايا المبرمج أن النسب المئوية للخلايا المبرمج المبكرة والمتأخرة والكلية كانت أعلى بكثير في المجموعة النموذجية منها في المجموعة الطبيعية. بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، كانت النسب المئوية للخلايا المبرمج في كل مرحلة أقل بكثير في مجموعة العلاج. كانت شدة التألق ل caspase-3 أقل بكثير في كل مجموعة علاج مقارنة بمجموعة النموذج ، وكانت أقل نسبيا في مجموعة تركيبة المكونات.
كشف التعبير النسبي للجينات Akt و Bcl-2 و Bax أن تركيبة المكونات متفوقة على تركيبة التحضير في تعزيز بقاء الخلية ، والتي ترتبط بالتأثير الأقوى المضاد لموت الخلايا المبرمج. أظهرت تركيبة المكونات تأثيرا أفضل للضرر المضاد للأكسدة من تركيبة المستحضر ، وتعبيرا أعلى بكثير عن بروتين Nrf2. يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص وتقييم تركيبة المكونات مع الأنشطة الدوائية المحتملة الأخرى من تركيبة الأعشاب ، مثل مضادات الالتهاب والمضادة للبكتيريا والمزيد.
