Le protocole de cette étude fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 endommagées par l’hypoxie, et une référence pour optimiser le meilleur mode de combinaison d’herbes. Cette technique peut fournir une méthode expérimentale in vitro simple, fiable et efficace pour cribler la combinaison d’ingrédients efficaces à partir d’herbes, contre les cellules hypoxiales. Cette stratégie peut également être appliquée pour cribler les combinaisons de composants contre les cellules hypoxieuses d’autres combinaisons de préparation d’herbes, et illustrer leur mécanisme de protection.
Pour commencer, sous-culture des cellules PC12 tous les deux à trois jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur supplémenté en 5% de dioxyde de carbone pour obtenir un passage de 4 à 8 pour toutes les expériences ultérieures. Traiter 70 à 80% de cellules PC12 confluentes avec un millilitre de trypsine 0,25% et observer les cellules au microscope pour le décollement cellulaire. Ensuite, arrêtez la digestion de la trypsine en ajoutant trois millilitres du milieu complet.
Faites tourner les cellules transférées dans un tube centrifuge de 15 millilitres à 840 x g pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule avec le milieu complet et transférer la suspension de cellule dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Pour compter les cellules, démarrez le logiciel de cytométrie en flux et sélectionnez le multiple de dilution correspondant de la solution cellulaire dans le paramètre de comptage.
Cliquez sur Tableau de densité après avoir chargé l’échantillon de cellule. Encerclez la population cellulaire loin de l’axe des x et de l’axe des y. Cliquez avec le bouton droit sur le tableau de données sous la figure et sélectionnez X, Y, Count et Abs.
Count pour obtenir les résultats du comptage de cellules sous le tableau de données de Abs.Count. Après avoir ajusté la concentration cellulaire environ à 1 fois 10 à 5ème cellules par millilitre avec le milieu complet, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits à une plaque de 96 puits et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, à la plaque jetée par surnageant, ajoutez 120 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution de MTT dans chaque puits et incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, une fois le surnageant jeté, ajoutez 150 microlitres de DMSO à chaque puits. Maintenir la plaque sous agitation dans un oscillateur vortex pendant 10 minutes à une vitesse de 240 fois par minute. Mesurez ensuite l’absorbance à 490 nanomètres dans un lecteur de microplaques.
Pour cribler la combinaison optimale de médicaments par une méthode de conception homogène, cultiver les cellules comme démontré précédemment et traiter les cellules PC12 blessées avec six concentrations de proportion différentes d’injection d’astragale et de capsule de breviscapus. Pour évaluer l’effet protecteur de deux combinaisons optimales, traiter les cellules PC12 blessées avec les deux types de combinaison de médicaments. Incuber les cellules pendant 24 heures et calculer la viabilité cellulaire comme démontré précédemment.
Ensemencer les cellules PC12 dans une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après un traitement médicamenteux, traiter les cellules avec 250 microlitres de trypsine par puits et centrifuger les cellules à 840 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule avec 500 microlitres de tampon de liaison.
Ajouter 5 microlitres d’annexine V-FITC, 10 microlitres d’iodure de propidium en triplicates pour chaque groupe, et incuber les cellules dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante pour vérifier l’apoptose en utilisant la cytométrie en flux. Dans le logiciel de cytomètre en flux, cliquez sur Compensation automatique dans le menu Démarrer, sélectionnez FITC, PE, PerCP et APC dans le canal Sélectionner, puis sélectionnez Compensation en hauteur. Cliquez ensuite sur OK dans l’élément statistique : médiane.
Cliquez sur Carte de densité et encerclez la population cellulaire effective avec la méthode de comptage de cellules illustrée précédemment. Avec la fluorescence FITC comme paramètre de l’axe des x et d’autres fluorescence comme paramètre de l’axe y, créez une carte de densité. Cliquez sur Matrice de compensation dans le menu Démarrer et Coefficient dans la matrice de débordement.
Ensemencer les cellules PC12 dans les lames de couverture placées sur une plaque de 24 puits en trois et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après le traitement médicamenteux, rincer les lamelles de couverture deux fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, les fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes et perméabiliser avec 0,5% Triton X-100 pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir rincé les cellules, bloquez-les avec du sérum de chèvre à 10% pendant une heure à température ambiante.
Ajouter 200 microlitres d’anticorps primaire dilué caspase-3 à chaque lamelle de couverture et incuber pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, laver trois fois avec un tampon TBST pendant trois minutes chacun, et incuber avec 200 microlitres d’anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, incuber les lamelles de couverture avec 300 microlitres de 0,5 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes et laver les cellules trois fois avec du TBST pendant cinq minutes chacune.
Capturez les images de la feuille de couverture sous un microscope à fluorescence et analysez statistiquement l’intensité de fluorescence avec le logiciel d’imagerie. Lavez la couvercle des cellules PC12 traitées trois fois avec du PBS pendant trois minutes chacune et incuber avec 400 microlitres de diacétate de dichloro-dihydro-fluorescéine micromolaire à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Lavez à nouveau les cellules avec du DMEM sans sérum deux fois pendant trois minutes chacune.
Ajoutez l’agent de trempe à fluorescence et capturez immédiatement les images de la lamelle de couverture sous un microscope à fluorescence pour calculer l’intensité relative de fluorescence avec le logiciel d’imagerie. Lavez les cellules PC12 traitées par le médicament dans une plaque de 6 puits trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans le tampon de lyse préparé de 100 microlitres par puits. Après lyse, centrifuger les cellules à 16 000 x g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius pour recueillir le surnageant.
Après avoir détecté la concentration de protéines par le test Bradford, exécutez une électrophorèse SDS-PAGE à 12% avec 25 microgrammes de protéines dans chaque voie et transférez le gel sur la membrane PVDF. Bloquer les membranes avec 5% de lait écrémé pendant 1,5 heure à température ambiante et incuber avec cinq millilitres des anticorps primaires correspondants pendant 24 heures à 4 degrés Celsius. Après l’incubation et le lavage de la membrane avec TBST trois fois pendant 10 minutes chacun, incuber avec cinq millilitres d’anticorps secondaires conjugués HRP à température ambiante pendant deux heures.
Enfin, à la membrane lavée par TBST, ajoutez un substrat HRP chimiluminescent pour la détection des bandes protéiques selon les instructions du fabricant. Capturez ensuite les images à l’aide du système d’imagerie par chimiluminescence pour quantifier les valeurs de gris des protéines, avec la bêta-actine comme contrôle interne. La viabilité cellulaire sur les cellules PC12 normales était inférieure à 95% avec injection d’astragale à des concentrations supérieures à 12 micromolaires et supérieures à 5 micromolaires pour la capsule breviscapus.
L’injection d’astragale pourrait améliorer le taux de survie des cellules PC12 blessées dans la plage de concentration de 6 à 12 micromolaires et de la capsule de breviscapus à 2 à 5 micromolaires. Alors que la combinaison de médicaments à un rapport de 6 à 1,8 micromolaire présentait la viabilité cellulaire la plus élevée. La viabilité cellulaire des deux combinaisons sur les cellules PC12 lésées a été significativement favorisée, et la combinaison de composants était supérieure à la combinaison de préparation.
Le taux d’apoptose a montré que les pourcentages de cellules apoptotiques précoces, tardives et totales étaient significativement plus élevés dans le groupe témoin que dans le groupe normal. Par rapport au groupe témoin, les pourcentages de cellules apoptotiques à chaque stade étaient significativement plus faibles dans le groupe de traitement. L’intensité de fluorescence de la caspase-3 était significativement plus faible dans chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin, et était relativement plus faible dans le groupe de combinaison de composants.
L’expression relative des gènes Akt, Bcl-2 et Bax a révélé que la combinaison de composants est supérieure à la combinaison de préparation pour favoriser la survie cellulaire, ce qui est lié à l’effet anti-apoptose plus fort. La combinaison de composants a montré un meilleur effet anti-oxydatif que celui de la combinaison de préparation, et une expression significativement plus élevée de la protéine Nrf2. Cette méthode peut être utilisée pour dépister et évaluer la combinaison de composants avec d’autres activités pharmacologiques potentielles de la combinaison d’herbes, telles que les anti-inflammatoires, les antibactériens, etc.
