הפרוטוקול במחקר זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 שניזוקו מהיפוקסיה, והתייחסות למיטוב המצב המשולב הטוב ביותר של צמחי מרפא. טכניקה זו יכולה לספק שיטה ניסיונית פשוטה, אמינה ויעילה במבחנה לסינון שילוב המרכיבים היעיל מצמחי מרפא, כנגד תאים היפוקסיאליים. אסטרטגיה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לסנן את שילובי המרכיבים כנגד תאים היפוקסיאליים משילובי הכנת צמחים אחרים, ולהמחיש את מנגנון ההגנה שלהם.
כדי להתחיל, תת-תרבית של תאי PC12 כל יומיים-שלושה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור בתוספת 5% פחמן דו חמצני כדי לקבל מעבר של 4 עד 8 עבור כל הניסויים הבאים. יש לטפל בתאי PC12 בנפח של 70% עד 80% עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין, ולצפות בתאים תחת מיקרוסקופ לצורך ניתוק תאים. לאחר מכן לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של המדיום המלא.
סובב את התאים המועברים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ב 840 x גרם במשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את גלולת התא עם המדיום המלא והעבר את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי לספור את התאים, הפעל את תוכנת ציטומטריית הזרימה ובחר את מכפילת הדילול המתאימה של תמיסת התא בהגדרת הספירה.
לחץ על תרשים צפיפות לאחר טעינת דוגמת התא. הקיפו את אוכלוסיית התאים הרחק מציר ה-x ומציר ה-y. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על טבלת הנתונים מתחת לאיור ובחר X, Y, Count ו- ABS.
ספור כדי לקבל את תוצאות ספירת התאים תחת טבלת הנתונים של Abs.Count. לאחר התאמת ריכוז התא בערך עד 1 כפול 10 לתאים 5 למיליליטר עם המדיום המלא, להוסיף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר לצלחת 96 באר ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. למחרת, לצלחת הסופר-זרוקה מוסיפים 120 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת MTT בכל באר, ודגרים במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, לאחר השלכת הסופרנאטנט, הוסיפו 150 מיקרוליטר DMSO לכל באר. שמור את הצלחת תחת רעד במתנד מערבולת במשך 10 דקות במהירות של 240 פעמים בדקה. לאחר מכן מדוד את הספיגה ב 490 ננומטר בקורא microplate.
כדי לסנן את השילוב האופטימלי של תרופות בשיטת תכנון הומוגנית, תרבית את התאים כפי שהודגם קודם לכן וטפל בתאי PC12 הפגועים עם שישה ריכוזי פרופורציה שונים של הזרקת אסטרגלוס וקפסולה breviscapus. כדי להעריך את ההשפעה המגנה של שני שילובים אופטימליים, לטפל בתאי PC12 הפגועים עם שני סוגים של שילוב של תרופות. דגרו על התאים במשך 24 שעות וחשבו את כדאיות התא כפי שהודגם קודם לכן.
זרעו את תאי PC12 בצלחת של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הטיפול התרופתי, יש לטפל בתאים עם 250 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ולצנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 840 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא עם 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה.
הוסף 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC, 10 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום בטריפליקט לכל קבוצה, ודגר על התאים בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבדוק אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה. בתוכנת ציטומטר הזרימה, לחץ על פיצוי אוטומטי בתפריט התחלה, בחר FITC, PE, PerCP ו- APC בערוץ בחר ובחר פיצוי בגובה. לאחר מכן לחץ על אישור בפריט סטטיסטי:חציון.
לחץ על מפת צפיפות והקף בעיגול את אוכלוסיית התאים האפקטיבית באמצעות שיטת ספירת התאים שהודגמה קודם לכן. עם פלואורסצנטיות FITC כפרמטר ציר x ופלואורסצנטיות אחרת כפרמטר ציר y, צור מפת צפיפות. לחץ על מטריצת פיצוי בתפריט התחלה ומקדם במטריצת הגלישה.
זרעו את תאי PC12 לכיסויים שהונחו על צלחת של 24 בארות היטב בטריפליקטים, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הטיפול התרופתי, שטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, תקנו אותם עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות, וחדרו עם 0.5% Triton X-100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים, חוסמים אותם בסרום 10% עיזים למשך שעה בטמפרטורת החדר.
יש להוסיף 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל קספאז-3 לכל כיסוי ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך שלוש דקות כל אחת, ודגרו עם 200 מיקרוליטר של נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, יש לדגור על הכיסויים עם 300 מיקרוליטר של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר DAPI למשך 10 דקות, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות כל אחד.
צלם את תמונות הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונתח סטטיסטית את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת ההדמיה. שטפו את כיסוי תאי PC12 שטופל בתרופה שלוש פעמים עם PBS במשך שלוש דקות כל אחד ודגרו עם 400 מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי דיכלורו-דיהידרו-פלואורסצאין דיאצטט ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטפו שוב את התאים עם DMEM ללא סרום פעמיים במשך שלוש דקות כל אחד.
הוסף את חומר המרווה הפלואורסצנטי וצלם מיד את תמונות הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית באמצעות תוכנת ההדמיה. שטפו את תאי PC12 שטופלו בתרופות בצלחת בת 6 בארות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת, ודגרו על קרח במשך 30 דקות במאגר הליזיס המוכן של 100 מיקרוליטר לבאר. בעקבות ליזה, צנטריפוגה את התאים ב 16, 000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את supernatant.
לאחר זיהוי ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד, הפעל אלקטרופורזה של 12% SDS-PAGE עם 25 מיקרוגרם חלבון בכל נתיב והעבר את הג'ל לקרום PVDF. לחסום את הממברנות עם חלב 5% שומן במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר, לדגור עם חמישה מיליליטר של נוגדנים ראשוניים המתאימים במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה ושטיפת הממברנה עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, יש לדגור עם חמישה מיליליטר של נוגדנים מצומדים משניים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
לבסוף, לקרום השטוף TBST, הוסף מצע HRP כימילומינסנטי לזיהוי רצועת חלבונים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן צלם את התמונות באמצעות מערכת ההדמיה הכימילומינסנטית כדי לכמת את הערכים האפורים של החלבונים, עם בטא-אקטין כבקרה פנימית. יכולת הקיום של התא בתאי PC12 הרגילים הייתה נמוכה מ-95% עם הזרקת אסטרגלוס בריכוזים גדולים מ-12 מיקרומולרים, ויותר מ-5 מיקרומולרים עבור קפסולת ה-breviscapus.
הזרקת אסטרגלוס יכולה לשפר את שיעור ההישרדות של תאי PC12 הפגועים בטווח ריכוז של 6 עד 12 מיקרומולרים, וקפסולת breviscapus בטווח של 2 עד 5 מיקרומולרית. ואילו שילוב התרופות ביחס של 6 עד 1.8 מיקרומולר הציג את הכדאיות התאית הגבוהה ביותר. יכולת הקיום של שני הצירופים על תאי PC12 הפגועים קודמה באופן משמעותי, ושילוב הרכיבים היה עדיף על שילוב ההכנה.
שיעור האפופטוזיס הראה כי אחוזי התאים האפופטוטיים המוקדמים, המאוחרים והכוללים היו גבוהים משמעותית בקבוצת המודל מאשר בקבוצה הרגילה. בהשוואה לקבוצת המודל, אחוזי התאים האפופטוטיים בכל שלב היו נמוכים משמעותית בקבוצת הטיפול. עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 הייתה נמוכה משמעותית בכל קבוצת טיפול בהשוואה לקבוצת המודל, והייתה נמוכה יחסית בקבוצת שילוב הרכיבים.
ביטוי יחסי של הגנים Akt, Bcl-2 ו-Bax גילה כי שילוב המרכיבים עדיף על שילוב ההכנה בקידום הישרדות התא, הקשור לאפקט האנטי-אפופטוזיס החזק יותר. שילוב הרכיבים הציג אפקט נזק נוגד חמצון טוב יותר מזה של שילוב ההכנה, וביטוי גבוה משמעותית של חלבון Nrf2. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסנן ולהעריך את שילוב הרכיבים עם פעילויות פרמקולוגיות פוטנציאליות אחרות משילוב העשבים, כגון אנטי דלקתיות, אנטיבקטריאליות ועוד.
