Das Protokoll in dieser Studie bietet eine Kombinationsstrategie von zwei Kräutern zur Behandlung von Hypoxie-geschädigten PC12-Zellen und eine Referenz für die Optimierung des besten Kombinationsmodus von Kräutern. Diese Technik kann eine einfache, zuverlässige und effiziente In-vitro-Versuchsmethode zum Screening der wirksamen Wirkstoffkombination aus Kräutern gegen hypoxiale Zellen bieten. Diese Strategie kann auch angewendet werden, um die Komponentenkombinationen gegen hypoxiale Zellen aus anderen Kräuterzubereitungskombinationen zu screenen und ihren Schutzmechanismus zu veranschaulichen.
Zunächst werden die PC12-Zellen alle zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius in einem mit 5% Kohlendioxid angereicherten Inkubator subkultiviert, um eine Passage von 4 bis 8 für alle nachfolgenden Experimente zu erhalten. Behandeln Sie 70 bis 80% konfluente PC12-Zellen mit einem Milliliter 0,25% Trypsin und beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop auf Zellablösung. Dann stoppen Sie die Trypsin-Verdauung, indem Sie drei Milliliter des gesamten Mediums hinzufügen.
Schleudern Sie die übertragenen Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei 840 x g für fünf Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet mit dem vollständigen Medium resuspendiert und die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Um die Zellen zu zählen, starten Sie die Durchflusszytometrie-Software und wählen Sie das entsprechende Verdünnungsvielfache der Zelllösung in der Zähleinstellung aus.
Klicken Sie auf Dichtediagramm, nachdem Sie die Zellprobe geladen haben. Kreisen Sie die Zellpopulation von der x- und y-Achse weg. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datentabelle unter der Abbildung, und wählen Sie X, Y, Anzahl und Abs aus.
Count, um die Ergebnisse der Zellzählung unter der Datentabelle von Abs.Count zu erhalten. Nach Einstellung der Zellkonzentration auf ca. 1 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter mit dem kompletten Medium 100 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte geben und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Am nächsten Tag werden in jeder Vertiefung 120 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter MTT-Lösung zu der überstehenden verworfenen Platte gegeben und vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Nach der Inkubation, sobald der Überstand verworfen ist, geben Sie 150 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung. Halten Sie die Platte 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 240 Mal pro Minute in einem Wirbeloszillator unter Schütteln. Messen Sie dann die Absorption bei 490 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader.
Um die optimale Kombination von Medikamenten durch eine homogene Designmethode zu untersuchen, kultivieren Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt, und behandeln Sie die verletzten PC12-Zellen mit sechs verschiedenen Anteilskonzentrationen von Astragalus-Injektion und Breviscapus-Kapsel. Um die Schutzwirkung von zwei optimalen Kombinationen zu bewerten, behandeln Sie die verletzten PC12-Zellen mit den beiden Arten von Kombinationen von Medikamenten. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden und berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit, wie zuvor gezeigt.
Die PC12-Zellen in einer 12-Well-Platte aussäen und 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Zellen mit 250 Mikroliter Trypsin pro Vertiefung behandelt und die Zellen bei 840 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wird das Zellpellet mit 500 Mikrolitern des Bindungspuffers resuspendiert.
Fügen Sie 5 Mikroliter Annexin V-FITC, 10 Mikroliter Propidiumiodid in Triplikat für jede Gruppe hinzu und inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Apoptose mittels Durchflusszytometrie zu überprüfen. Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software im Startmenü auf Automatische Kompensation, wählen Sie FITC, PE, PerCP und APC im Auswahlkanal aus, und wählen Sie Kompensation in der Höhe aus. Klicken Sie dann im Feld Statistisches Element:Median auf OK.
Klicken Sie auf Dichtematrix, und kreisen Sie die effektive Zellpopulation mit der zuvor gezeigten Zellzählungsmethode ein. Erstellen Sie mit der FITC-Fluoreszenz als x-Achsenparameter und einer anderen Fluoreszenz als y-Achsenparameter eine Dichtekarte. Klicken Sie im Startmenü auf Kompensationsmatrix und in der Überlaufmatrix auf Koeffizient.
Die PC12-Zellen werden in dreifacher Aussaat auf die Deckgläser auf einer 24-Well-Plattenmulde ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Spülen Sie die Deckgläser nach der medikamentösen Behandlung zweimal mit PBS für jeweils fünf Minuten, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten und permeabilisieren Sie mit 0,5% Triton X-100 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Spülen der Zellen blockieren Sie sie mit 10% Ziegenserum für eine Stunde bei Raumtemperatur.
200 Mikroliter verdünnter primärer Antikörper Caspase-3 in jedes Deckglas geben und über Nacht bei 4 Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag dreimal mit TBST-Puffer für jeweils drei Minuten waschen und mit 200 Mikrolitern sekundärem Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation werden die Deckgläser 10 Minuten lang mit 300 Mikrolitern 0,5 Mikrogramm pro Milliliter DAPI inkubiert und die Zellen dreimal mit TBST für jeweils fünf Minuten gewaschen.
Erfassen Sie die Deckglasbilder unter einem Fluoreszenzmikroskop und analysieren Sie die Fluoreszenzintensität mit der Bildgebungssoftware statistisch. Das medikamentös behandelte PC12-Zelldeckglas dreimal mit PBS für jeweils drei Minuten waschen und mit 400 Mikrolitern 10 mikromolaren Dichlordihydrofluoresceindiacetat bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Zellen erneut zweimal für jeweils drei Minuten mit serumfreiem DMEM.
Fügen Sie das Fluoreszenzlöschmittel hinzu und nehmen Sie die Deckglasbilder sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop auf, um die relative Fluoreszenzintensität mit der Bildgebungssoftware zu berechnen. Die medikamentös behandelten PC12-Zellen werden in einer 6-Well-Platte dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten gewaschen und 30 Minuten lang auf Eis in dem vorbereiteten Lysepuffer von 100 Mikrolitern pro Vertiefung inkubiert. Nach der Lyse werden die Zellen bei 16.000 x g für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugiert, um den Überstand aufzufangen.
Nach dem Nachweis der Proteinkonzentration durch Bradford-Assay wird eine 12%ige SDS-PAGE-Elektrophorese mit 25 Mikrogramm Protein in jeder Spur durchgeführt und das Gel auf die PVDF-Membran übertragen. Blockieren Sie die Membranen mit 5% fettfreier Milch für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und inkubieren Sie mit fünf Millilitern der entsprechenden primären Antikörper für 24 Stunden bei 4 Grad Celsius. Nach Inkubation und dreimaligem Waschen der Membran mit TBST für jeweils 10 Minuten wird mit fünf Millilitern sekundärer HRP-konjugierter Antikörper bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubiert.
Zum Schluss fügen Sie der TBST-gewaschenen Membran ein chemilumineszierendes HRP-Substrat für die Proteinbandenerkennung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Nehmen Sie dann die Bilder mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf, um die Grauwerte der Proteine zu quantifizieren, wobei Beta-Aktin als interne Kontrolle dient. Die Zelllebensfähigkeit auf den normalen PC12-Zellen betrug weniger als 95% bei Astragalus-Injektion in Konzentrationen von mehr als 12 Mikromolaren und mehr als 5 Mikromolaren für die Breviscapus-Kapsel.
Die Astragalus-Injektion könnte die Überlebensrate der verletzten PC12-Zellen im Konzentrationsbereich von 6 bis 12 Mikromolaren und der Breviscapus-Kapsel bei 2 bis 5 Mikromolaren verbessern. Während die Wirkstoffkombination in einem Verhältnis von 6 bis 1,8 Mikromolar die höchste Zelllebensfähigkeit aufwies. Die Zelllebensfähigkeit der beiden Kombinationen auf den verletzten PC12-Zellen war signifikant gefördert, und die Komponentenkombination war der Präparationskombination überlegen.
Die Apoptoserate zeigte, dass die Prozentsätze der frühen, späten und gesamten apoptotischen Zellen in der Modellgruppe signifikant höher waren als in der normalen Gruppe. Im Vergleich zur Modellgruppe war der Anteil apoptotischer Zellen in jedem Stadium in der Behandlungsgruppe signifikant niedriger. Die Fluoreszenzintensität von Caspase-3 war in jeder Behandlungsgruppe im Vergleich zur Modellgruppe signifikant niedriger und in der Komponentenkombinationsgruppe relativ niedriger.
Die relative Expression der Gene Akt, Bcl-2 und Bax zeigte, dass die Komponentenkombination der Präparationskombination bei der Förderung des Zellüberlebens überlegen ist, was mit dem stärkeren Anti-Apoptose-Effekt zusammenhängt. Die Komponentenkombination zeigte eine bessere antioxidative Schädigungswirkung als die der Präparationskombination und eine signifikant höhere Expression des Nrf2-Proteins. Diese Methode kann verwendet werden, um die Komponentenkombination mit anderen potenziellen pharmakologischen Aktivitäten aus der Kräuterkombination, wie z. B. entzündungshemmend, antibakteriell und mehr, zu untersuchen und zu bewerten.
