O protocolo neste estudo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para o tratamento de células PC12 danificadas por hipóxia e uma referência para otimizar o melhor modo de combinação de ervas. Esta técnica pode fornecer um método experimental in vitro simples, confiável e eficiente para rastrear a combinação eficaz de ingredientes de ervas contra células hipóxicas. Essa estratégia também pode ser aplicada para rastrear as combinações de componentes contra células hipóxias de outras combinações de preparação de ervas e ilustrar seu mecanismo de proteção.
Para começar, sub-cultura das células PC12 a cada dois a três dias a 37 graus Celsius em uma incubadora suplementada com 5% de dióxido de carbono para obter uma passagem de 4 a 8 para todos os experimentos subsequentes. Trate 70 a 80% de células PC12 confluentes com um mililitro de 0,25% de tripsina e observe as células sob um microscópio para descolamento celular. Em seguida, pare a digestão da tripsina adicionando três mililitros do meio completo.
Gire as células transferidas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros a 840 x g por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite o pellet celular com o meio completo e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para contar as células, inicie o software de citometria de fluxo e selecione o múltiplo de diluição correspondente da solução celular na configuração de contagem.
Clique em Gráfico de densidade depois de carregar a amostra de célula. Circule a população de células para longe dos eixos x e y. Clique com o botão direito do mouse na tabela de dados abaixo da figura e selecione X, Y, Contagem e Abs.
Conte para obter os resultados da contagem de células na tabela de dados de Abs.Count. Depois de ajustar a concentração celular aproximadamente a 1 vezes 10 para a 5ª célula por mililitro com o meio completo, adicione 100 microlitros da suspensão celular por poço a uma placa de 96 poços e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, à placa descartada do sobrenadante, adicione 120 microlitros de um miligrama por mililitro de solução de MTT em cada poço e incube por quatro horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação, uma vez que o sobrenadante é descartado, adicione 150 microlitros de DMSO a cada poço. Mantenha a placa sob agitação em um oscilador de vórtice por 10 minutos a uma velocidade de 240 vezes por minuto. Em seguida, meça a absorvância a 490 nanômetros em um leitor de microplacas.
Para rastrear a combinação ideal de drogas pelo método de design homogêneo, cultivar as células conforme demonstrado anteriormente e tratar as células PC12 lesadas com seis concentrações de proporção diferentes de injeção de Astragalus e cápsula de breviscapus. Para avaliar o efeito protetor de duas combinações ideais, trate as células PC12 lesadas com os dois tipos de combinação de drogas. Incubar as células por 24 horas e calcular a viabilidade celular como demonstrado anteriormente.
Semeia as células PC12 em uma placa de 12 poços e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após o tratamento medicamentoso, trate as células com 250 microlitros de tripsina por poço e centrifugar as células a 840 x g por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet celular com 500 microlitros do tampão de ligação.
Adicionar 5 microlitros de anexina V-FITC, 10 microlitros de iodeto de propídio em triplicados para cada grupo e incubar as células no escuro por 15 minutos à temperatura ambiente para verificar se há apoptose usando citometria de fluxo. No software do citômetro de fluxo, clique em Compensação Automática no menu Iniciar, selecione FITC, PE, PerCP e APC no canal Selecionar e selecione Compensação em Altura. Em seguida, clique em OK no Item Estatístico:Mediana.
Clique em Mapa de Densidade e circule a população de células efetiva com o método de contagem de células demonstrado anteriormente. Com a fluorescência FITC como parâmetro do eixo x e outras fluorescências como o parâmetro do eixo y, crie um mapa de densidade. Clique em Matriz de compensação no menu Iniciar e Coeficiente na matriz de estouro.
Semeia as células PC12 para as folhas de cobertura colocadas em um poço de placa de 24 poços em triplicados e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após o tratamento medicamentoso, enxaguar as coberturas duas vezes com PBS por cinco minutos cada, fixá-las com paraformaldeído a 4% por 15 minutos e permeabilizar com 0,5%Triton X-100 por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de enxaguar as células, bloqueie-as com soro de cabra a 10% durante uma hora à temperatura ambiente.
Adicione 200 microlitros de caspase-3 do anticorpo primário diluído a cada folha de cobertura e incube durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave três vezes com tampão TBST por três minutos cada e incube com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, incubar as tampas com 300 microlitros de 0,5 microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos e lavar as células três vezes com TBST por cinco minutos cada.
Capture as imagens de cobertura sob um microscópio de fluorescência e analise estatisticamente a intensidade da fluorescência com o software de imagem. Lave a tampa da célula PC12 tratada com fármaco três vezes com PBS por três minutos cada e incube com 400 microlitros de 10 diacetatos micromolares de dicloro-diidro-fluoresceína a 37 graus Celsius por 20 minutos. Lave as células novamente com DMEM sem soro duas vezes por três minutos cada.
Adicione o agente de têmpera de fluorescência e capture imediatamente as imagens de folha de cobertura sob um microscópio de fluorescência para calcular a intensidade relativa de fluorescência com o software de imagem. Lave as células PC12 tratadas com drogas em uma placa de 6 poços três vezes com PBS por cinco minutos cada e incube no gelo por 30 minutos no tampão de lise preparado de 100 microlitros por poço. Após a lise, centrifugar as células a 16.000 x g por 20 minutos a 4 graus Celsius para coletar o sobrenadante.
Depois de detectar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, execute uma eletroforese 12%SDS-PAGE com 25 microgramas de proteína em cada pista e transfira o gel para a membrana PVDF. Bloquear as membranas com 5% de leite desnatado por 1,5 horas à temperatura ambiente e incubar com cinco mililitros dos anticorpos primários correspondentes por 24 horas a 4 graus Celsius. Após incubação e lavagem da membrana com TBST três vezes por 10 minutos cada, incubar com cinco mililitros de anticorpos secundários conjugados com HRP à temperatura ambiente por duas horas.
Finalmente, à membrana lavada com TBST, adicione substrato quimioluminescente HRP para detecção de banda de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, capture as imagens usando o sistema de imagem de quimioluminescência para quantificar os valores de cinza das proteínas, com beta-actina como controle interno. A viabilidade celular nas células PC12 normais foi inferior a 95% com injeção de Astrágalo em concentrações superiores a 12 micromolares e superiores a 5 micromolares para a cápsula de breviscapus.
A injeção de astrágalo pode melhorar a taxa de sobrevivência das células PC12 lesadas na faixa de concentração de 6 a 12 micromolares e a cápsula de breviscapus em 2 a 5 micromolares. Considerando que a combinação de drogas em uma proporção de 6 a 1,8 micromolar exibiu a maior viabilidade celular. A viabilidade celular das duas combinações nas células PC12 lesadas foi significativamente promovida e a combinação de componentes foi superior à combinação de preparação.
A taxa de apoptose mostrou que as porcentagens de células apoptóticas precoces, tardias e totais foram significativamente maiores no grupo modelo do que no grupo normal. Em comparação com o grupo modelo, as porcentagens de células apoptóticas em cada estágio foram significativamente menores no grupo de tratamento. A intensidade de fluorescência da caspase-3 foi significativamente menor em cada grupo de tratamento em comparação com o grupo modelo, e foi relativamente menor no grupo de combinação de componentes.
A expressão relativa dos genes Akt, Bcl-2 e Bax revelou que a combinação de componentes é superior à combinação de preparação na promoção da sobrevivência celular, o que está relacionado ao efeito anti-apoptose mais forte. A combinação de componentes exibiu um melhor efeito de dano antioxidante do que o da combinação de preparação e uma expressão significativamente maior da proteína Nrf2. Este método pode ser usado para rastrear e avaliar a combinação de componentes com outras atividades farmacológicas potenciais da combinação de ervas, como anti-inflamatórias, antibacterianas e muito mais.
