Bu çalışmadaki protokol, hipoksi hasarlı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitkinin bir kombinasyon stratejisini ve bitkilerin en iyi kombinasyon modunu optimize etmek için bir referans sunmaktadır. Bu teknik, hipoksiyal hücrelere karşı bitkilerden etkili bileşen kombinasyonunu taramak için basit, güvenilir ve verimli bir in vitro deneysel yöntem sağlayabilir. Bu strateji, bileşen kombinasyonlarını diğer bitki hazırlama kombinasyonlarından hipoksiyal hücrelere karşı taramak ve koruyucu mekanizmalarını göstermek için de uygulanabilir.
Başlamak için, PC12 hücrelerini her iki ila üç günde bir 37 santigrat derecede bir inkübatörde, sonraki tüm deneyler için 4 ila 8'lik bir geçiş elde etmek için% 5 karbondioksit ile desteklenmiş bir inkübatörde alt kültüre alın. Bir mililitre% 0.25 tripsin ile% 70 ila% 80 akışkan PC12 hücrelerini tedavi edin ve hücreleri hücre ayrılması için mikroskop altında gözlemleyin. Ardından, tam ortamın üç mililitresini ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.
Aktarılan hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde beş dakika boyunca 840 x g'de döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini tam ortamla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri saymak için, akış sitometrisi yazılımını başlatın ve sayım ayarında hücre çözeltisinin karşılık gelen seyreltme katını seçin.
Hücre örneğini yükledikten sonra Yoğunluk Grafiği'ne tıklayın. Hücre popülasyonunu x ekseninden ve y ekseninden uzağa daire içine alın. Şeklin altındaki veri tablosuna sağ tıklayın ve X, Y, Count ve Abs'yi seçin.
Abs.Count veri tablosu altında hücre sayım sonuçlarını almak için sayım. Hücre konsantrasyonunu, tam ortamla mililitre başına 5. hücrelere yaklaşık 1 kez 10 kez ayarladıktan sonra, kuyucuk başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 96 delikli bir plakaya ekleyin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, süper atılan plakaya, her bir kuyucuğa mililitre MTT çözeltisi başına 120 mikrolitre bir miligram ekleyin ve 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, süpernatant atıldıktan sonra, her bir kuyucuğa 150 mikrolitre DMSO ekleyin. Plakayı bir vorteks osilatöründe dakikada 240 kez 10 dakika boyunca sallanma altında tutun. Daha sonra bir mikroplaka okuyucuda 490 nanometrede absorbansı ölçün.
İlaçların optimal kombinasyonunu homojen tasarım yöntemiyle taramak için, hücreleri daha önce gösterildiği gibi kültürlendirin ve yaralı PC12 hücrelerini altı farklı oranda Astragalus enjeksiyonu ve breviscapus kapsülü konsantrasyonu ile tedavi edin. İki optimal kombinasyonun koruyucu etkisini değerlendirmek için, yaralı PC12 hücrelerini iki tip ilaç kombinasyonu ile tedavi edin. Hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin ve daha önce gösterildiği gibi hücre canlılığını hesaplayın.
PC12 hücrelerini 12 delikli bir plakaya tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İlaç tedavisini takiben, hücreleri kuyu başına 250 mikrolitre tripsin ile tedavi edin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 840 x g'de santrifüj edin. Daha sonra hücre peletini 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ile yeniden askıya alın.
Her grup için üçlü olarak 5 mikrolitre Ek V-FITC, 10 mikrolitre propidium iyodür ekleyin ve akış sitometrisi kullanarak apoptozu kontrol etmek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta hücreleri inkübe edin. Akış sitometresi yazılımında, Başlat menüsünde Otomatik Dengeleme'ye tıklayın, Seç kanalında FITC, PE, PerCP ve APC'yi seçin ve Yükseklikte Ücretlendirme'yi seçin. Ardından, İstatistiksel Öğe:Medyan'da Tamam'ı tıklatın.
Yoğunluk Haritası'na tıklayın ve daha önce gösterilen hücre sayma yöntemiyle etkili hücre popülasyonunu daire içine alın. X ekseni parametresi olarak FITC floresan ve y ekseni parametresi olarak diğer floresan ile bir yoğunluk haritası oluşturun. Başlat menüsündeki Ücret Matrisi'ne ve taşma matrisindeki Katsayı'ya tıklayın.
PC12 hücrelerini, üçlü olarak 24 delikli bir plaka kuyusuna yerleştirilen kapaklara tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İlaç tedavisini takiben, kapakları her biri beş dakika boyunca PBS ile iki kez durulayın, 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve% 0.5 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 20 dakika geçirgenleştirin. Hücreleri duruladıktan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca% 10 keçi serumu ile bloke edin.
Her bir kapak kaymasına 200 mikrolitre seyreltilmiş birincil antikor kaspaz-3 ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, her biri üç dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre ikincil antikor ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapakları 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 300 mikrolitre 0.5 mikrogram ile inkübe edin ve hücreleri her biri beş dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın.
Kapak kayması görüntülerini bir floresan mikroskobu altında yakalayın ve görüntüleme yazılımı ile floresan yoğunluğunu istatistiksel olarak analiz edin. İlaçla muamele edilmiş PC12 hücre kapağını PBS ile üç kez her biri üç dakika boyunca yıkayın ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede 400 mikrolitre 10 mikromolar dikloro-dihidro-floresein diasetat ile inkübe edin. Hücreleri her biri üç dakika boyunca iki kez serumsuz DMEM ile tekrar yıkayın.
Floresan söndürme maddesini ekleyin ve görüntüleme yazılımıyla göreceli floresan yoğunluğunu hesaplamak için hemen bir floresan mikroskobu altında kapak kayması görüntülerini yakalayın. İlaçla muamele edilmiş PC12 hücrelerini, her biri beş dakika boyunca PBS ile üç kez 6 delikli bir plakada yıkayın ve kuyucuk başına 100 mikrolitrelik hazırlanmış lizis tamponunda 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lizisten sonra, süpernatanı toplamak için hücreleri 16.000 x g'de 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Bradford testi ile protein konsantrasyonunu tespit ettikten sonra, her şeritte 25 mikrogram protein ile% 12'lik bir SDS-PAGE elektroforezi çalıştırın ve jeli PVDF membranına aktarın. Membranları oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca% 5 yağsız sütle bloke edin ve 4 santigrat derecede 24 saat boyunca karşılık gelen birincil antikorların beş mililitresi ile inkübe edin. Kuluçkadan ve membranı her biri 10 dakika boyunca üç kez TBST ile yıkadıktan sonra, iki saat boyunca oda sıcaklığında beş mililitre ikincil HRP konjuge antikorları ile inkübe edin.
Son olarak, TBST ile yıkanmış membrana, üreticinin talimatına göre protein bandı tespiti için kemilüminesan HRP substratı ekleyin. Ardından, proteinlerin gri değerlerini ölçmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak, iç kontrol olarak beta-aktin ile görüntüleri yakalayın. Normal PC12 hücrelerindeki hücre canlılığı, 12 mikromolardan daha büyük konsantrasyonlarda Astragalus enjeksiyonu ile% 95'ten düşüktü ve breviskapus kapsülü için 5 mikromolar'dan daha büyüktü.
Astragalus enjeksiyonu, 6 ila 12 mikromolar konsantrasyon aralığında yaralı PC12 hücrelerinin ve 2 ila 5 mikromolar'da breviscapus kapsülünün hayatta kalma oranını artırabilir. Oysa 6 ila 1.8 mikromolar oranındaki ilaç kombinasyonu en yüksek hücre canlılığını sergiledi. Yaralı PC12 hücreleri üzerindeki iki kombinasyonun hücre canlılığı önemli ölçüde desteklendi ve bileşen kombinasyonu preparat kombinasyonundan daha üstündü.
Apoptoz oranı, erken ve geç ve toplam apoptotik hücrelerin yüzdelerinin model grupta normal gruba göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Model grupla karşılaştırıldığında, her aşamada apoptotik hücrelerin yüzdeleri tedavi grubunda anlamlı derecede düşüktü. Kaspaz-3'ün floresan yoğunluğu, her tedavi grubunda model grubuna kıyasla anlamlı derecede düşüktü ve bileşen kombinasyon grubunda nispeten daha düşüktü.
Akt, Bcl-2 ve Bax genlerinin göreceli ekspresyonu, bileşen kombinasyonunun, daha güçlü anti-apoptoz etkisi ile ilişkili olan hücre sağkalımını teşvik etmede preparat kombinasyonundan daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. Bileşen kombinasyonu, preparat kombinasyonundan daha iyi bir anti-oksidatif hasar etkisi ve Nrf2 proteininin önemli ölçüde daha yüksek ekspresyonunu sergiledi. Bu yöntem, bileşen kombinasyonunu anti-enflamatuar, antibakteriyel ve daha fazlası gibi bitki kombinasyonundan diğer potansiyel farmakolojik aktivitelerle taramak ve değerlendirmek için kullanılabilir.
