이 연구의 프로토콜은 저산소증으로 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 허브의 조합 전략과 허브의 최상의 조합 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다. 이 기술은 저산소 세포에 대해 허브로부터 효과적인 성분 조합을 스크리닝하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 시험관 내 실험 방법을 제공할 수 있습니다. 이 전략은 또한 다른 허브 제제 조합으로부터의 저산소 세포에 대한 성분 조합을 스크리닝하고 그들의 보호 메커니즘을 설명하기 위해 적용될 수 있다.
시작하려면 5%이산화탄소가 보충된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2-3일마다 PC12 세포를 계대 배양하여 모든 후속 실험에 대해 4 내지 8의 계대 배양을 얻습니다. 70 내지 80%의 융합성 PC12 세포를 0.25%트립신 1밀리리터로 처리하고, 세포 박리를 현미경으로 관찰한다. 그런 다음 3 밀리리터의 완전한 배지를 추가하여 트립신 소화를 중지하십시오.
15밀리리터 원심분리 튜브에서 840 x g로 5분 동안 전사된 세포를 회전시킵니다. 상청액을 버린 후 세포 펠릿을 전체 배지로 재현탁하고 세포 현탁액을 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 계수하려면 유세포 분석 소프트웨어를 시작하고 계수 설정에서 세포 용액의 해당 희석 배수를 선택하십시오.
클릭 밀도 차트 셀 샘플을 로드한 후. 셀 모집단을 x축과 y축에서 멀리 원을 그립니다. 그림 아래의 데이터 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 X, Y, 개수 및 복근을 선택합니다.
개수를 매기면 Abs.Count의 데이터 테이블에서 셀 계수 결과를 얻을 수 있습니다. 완전한 배지로 밀리리터당 5번째 세포에 약 10배 10배로 세포 농도를 조정한 후 웰당 세포 현탁액 100마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 상청액 폐기 플레이트에 각 웰에 밀리리터 MTT 용액 당 1 밀리그램의 120 마이크로 리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 4 시간 동안 배양한다.
배양 후 상청액이 폐기되면 각 웰에 150마이크로리터의 DMSO를 추가합니다. 분당 240 회의 속도로 10 분 동안 와류 발진기에서 플레이트를 흔들어 두십시오. 그 다음 마이크로플레이트 리더에서 490 나노미터에서 흡광도를 측정한다.
균질한 설계 방법에 의해 약물의 최적 조합을 스크리닝하기 위해, 앞서 입증된 바와 같이 세포를 배양하고, 손상된 PC12 세포를 6개의 상이한 비율 농도의 황기 주사 및 브레비스카푸스 캡슐로 처리한다. 두 가지 최적의 조합의 보호 효과를 평가하려면 손상된 PC12 세포를 두 가지 유형의 약물 조합으로 치료하십시오. 세포를 24시간 동안 배양하고 앞에서 입증된 바와 같이 세포 생존율을 계산한다.
PC12 세포를 12웰 플레이트에 시드하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 약물 처리 후 세포를 웰당 250마이크로리터의 트립신으로 처리하고 실온에서 5분 동안 840 x g으로 세포를 원심분리합니다. 이어서, 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 결합 완충액으로 재현탁시킨다.
각 그룹마다 5 마이크로 리터의 Annexin V-FITC와 10 마이크로 리터의 요오드화 프로피듐을 삼중 물로 첨가하고 실온에서 15 분 동안 암실에서 세포를 배양하여 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸을 확인합니다. 유세포분석기 소프트웨어의 시작 메뉴에서 자동 보정을 클릭하고 선택 채널에서 FITC, PE, PerCP 및 APC를 선택한 다음 높이 보정을 선택합니다. 그런 다음 통계 항목:중앙값에서 확인을 클릭합니다.
밀도 맵을 클릭하고 앞에서 설명한 세포 계수 방법으로 유효 세포 집단에 동그라미를 칩니다. FITC 형광을 x축 파라미터로 사용하고 다른 형광을 y축 파라미터로 사용하여 밀도 맵을 생성합니다. 시작 메뉴에서 보상 매트릭스를 클릭하고 오버플로 매트릭스에서 계수를 클릭합니다.
PC12 세포를 24웰 플레이트 웰에 놓인 커버슬립에 삼중으로 시드하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 약물 치료 후 커버 슬립을 PBS로 각각 5 분 동안 두 번 헹구고 4 % 파라 포름 알데히드로 15 분 동안 고정하고 실온에서 0.5 % Triton X-100으로 20 분 동안 투과시킵니다. 세포를 헹군 후 실온에서 1시간 동안 10%염소 혈청으로 차단합니다.
희석된 1차 항체 카스파제-3 200마이크로리터를 각 커버슬립에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, TBST 완충액으로 각각 3분 동안 3회 세척하고, 200 마이크로리터의 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 커버슬립을 DAPI의 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 300 마이크로리터로 10분 동안 배양하고, 세포를 TBST로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
형광 현미경으로 커버슬립 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어로 형광 강도를 통계적으로 분석합니다. 약물-처리된 PC12 세포 커버슬립을 PBS로 각각 3분 동안 3회 세척하고, 섭씨 37도에서 400 마이크로리터의 10 마이크로몰 디클로로디클로로하이드로플루오레세인 디아세테이트와 함께 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 무혈청 DMEM으로 각각 3분 동안 두 번 다시 세척합니다.
형광 소광제를 추가하고 형광 현미경으로 커버슬립 이미지를 즉시 캡처하여 이미징 소프트웨어로 상대 형광 강도를 계산합니다. 약물 처리된 PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 PBS로 3회 각각 5분 동안 세척하고, 준비된 웰당 100 마이크로리터의 용해 완충액에서 30분 동안 얼음 상에서 배양한다. 용해 후, 세포를 섭씨 4도에서 20 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리하여 상청액을 수집한다.
Bradford 분석으로 단백질 농도를 검출한 후 각 레인에서 25마이크로그램의 단백질로 12%SDS-PAGE 전기영동을 실행하고 겔을 PVDF 막으로 옮깁니다. 실온에서 1.5 시간 동안 5 % 무 지방 우유로 막을 막고 섭씨 4도에서 24 시간 동안 상응하는 1 차 항체 5 밀리리터와 함께 배양한다. 배양 및 TBST로 막을 각각 10분 동안 3회 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 5밀리리터의 2차 HRP-접합 항체와 함께 배양한다.
마지막으로, TBST 세척 멤브레인에 제조업체의 지침에 따라 단백질 밴드 검출을 위한 화학발광 HRP 기질을 추가합니다. 그런 다음 화학 발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처하여 베타 액틴을 내부 대조군으로 사용하여 단백질의 회색 값을 정량화합니다. 정상 PC12 세포의 세포 생존율은 12 마이크로 몰 이상의 농도에서 황기 주사로 95 %보다 낮았고 breviscapus 캡슐의 경우 5 마이크로 몰 이상이었습니다.
황기 주사는 2 내지 5 마이크로몰에서 6 내지 12 마이크로몰 및 브레비스카푸스 캡슐의 농도 범위에서 손상된 PC12 세포의 생존율을 향상시킬 수 있었다. 반면 6 내지 1.8 마이크로몰의 비율로 약물 조합은 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다. 손상된 PC12 세포에 대한 두 조합의 세포 생존율은 상당히 촉진되었고, 성분 조합은 제제 조합보다 우수했습니다.
아폽토시스 비율은 초기, 후기 및 총 세포사멸 세포의 백분율이 정상 그룹에서보다 모델 그룹에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었다. 모델 그룹과 비교하여, 각 단계에서의 세포 사멸 세포의 비율은 치료 그룹에서 유의하게 낮았다. caspase-3의 형광 강도는 모델 그룹에 비해 각 처리군에서 유의하게 낮았으며, 성분 조합 군에서 상대적으로 낮았다.
Akt, Bcl-2 및 Bax 유전자의 상대적 발현은 성분 조합이 세포 생존을 촉진하는데 있어서 제제 조합보다 우수하다는 것을 밝혀냈으며, 이는 더 강한 항세포사멸 효과와 관련이 있다. 성분 조합은 제제 조합의 것보다 더 우수한 항산화 손상 효과를 나타내었고, Nrf2 단백질의 발현이 상당히 높았다. 이 방법은 항염증제, 항균제 등과 같은 허브 조합으로부터의 다른 잠재적인 약리학적 활성과 성분 조합을 선별하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
