يسمح بروتوكول PLA الخاص بنا بتحديد وقياس التفاعل الداخلي بين البروتينات في مواقع ملامسة الغشاء. لقد استخدمناه لدراسة التفاعل بين اثنين من بروتينات الشبكة الإندوبلازمية في مواقع اتصال الميتوكوندريا الشبكية الإندوبلازمية. تجمع هذه التقنية بين PLA وتلطيخ العضيات وتحليل مسافات العضيات.
يسمح بالتوطين والقياس الكمي في التفاعل بين البروتينات في مواقع ملامسة الغشاء بين العضيات. بعد إجراء فحص ربط القرب ، أو PLA ، والحصول على الصور ، قم بإعداد برنامج تحليل الخلايا لبدء تشغيل MATLAB وتشغيل ملحق بالنقر فوق الخيار Imaris في نظام التشغيل Mac أو قائمة التحرير في Windows. حدد التفضيلات، قم بالتغيير إلى لوحة الأدوات المخصصة، واضبط المسار.
لاستيراد الصور إلى البرنامج ، قم بتحويل صور المكدس متحد البؤر إلى ملف IMS ، إما مباشرة من خلال قسم الساحة أو باستخدام محول الملفات المستقل الذي يسمح بتحويل الدفعات. بعد الاستيراد ، انقر فوق تحرير ، وانتقل إلى خصائص الصورة ، وحدد هندسة الصورة للتحقق من معايرة الصورة. تحقق من أن حجم voxel يتوافق مع حجم البكسل المتوقع للصورة الفعلية في X و Y ، والخطوة التي يطبقها المجهر لإنشاء مكدس Z في Z.To ضبط تباين القنوات المختلفة ، انقر فوق تحرير في القائمة ، وانتقل إلى ضبط العرض ، وحدد إظهار ضبط العرض.
اضبط كل قناة بشكل مستقل لتحسين عرض كل لون. هذه الخطوة ضرورية لتعيين عتبات دقيقة أو اكتشاف الكائنات الضعيفة. ثم ، انقر فوق تحرير وحدد اقتصاص 3D لقصر التحليل على خلية واحدة عن طريق اقتصاص الصورة.
لتحليل خلية أخرى في نفس مجال الرؤية ، افتح نفس الصورة مرة أخرى وقم باقتصاصها بشكل مختلف. اكتشف إشارات PLA التي تم إنشاؤها في موقع تفاعل ORP5 و ORP8 بالنقر فوق خيار إضافة نقاط جديدة ، والذي ينشئ مجموعة جديدة من الكائنات ويفتح معالج اكتشاف البقعة. حدد القناة التي يجب إجراء الكشف الفوري عليها.
اضبط قطر XY المقدر لمساعدة خوارزمية اكتشاف البقعة في العثور على الكائنات محل الاهتمام. إذا كانت القيمة المختارة عالية جدا ، فسوف تندمج الكائنات القريبة ، وإذا كانت القيمة صغيرة جدا ، فقد يتم اكتشاف إشارات شاذة. الآن ، انقر فوق طرح الخلفية لإزالة خلفية الصورة قبل اكتشاف البقعة لتحسين التباين المحلي حول الكائنات محل الاهتمام.
اضبط عتبة الكشف الفوري عن طريق الحفاظ على الجودة كمعلمة عتبة في العتبة التلقائية للبرنامج ، أو قم بتعديل هذه القيمة قليلا لاكتشاف جميع الكائنات. بمجرد الانتهاء من اكتشاف البقعة ، احفظ معلمات الكشف وأعد استخدامها لمعالجة الصور الأخرى. بعد ذلك ، اكتشف شبكة الميتوكوندريا لإنشاء تجسيد سطحي بالنقر فوق إضافة أسطح جديدة لإنشاء كائن جديد وفتح معالج الكشف عن السطح.
حدد القناة التي يجب إجراء إنشاء السطح عليها. قم بتطبيق مرشح Gaussian للحصول على سطح أكثر نعومة بالنقر فوق مربع الاختيار الأملس ، وتعيين عتبة تشير إلى التفاصيل الصغيرة التي يمكن ملاحظتها على السطح. بعد ذلك ، قم بإجراء طرح في الخلفية لتعزيز التباينات المحلية وضبط العتبة للكشف عن شبكة الميتوكوندريا بناء على شدة الإشارة.
قم بتطبيق مرشح على السطح لإزالة البقايا الصغيرة من العتبة عن طريق تحديد عدد مرشح voxels في نافذة تصنيف السطح ، واللعب مع العتبات العلوية والسفلية للاحتفاظ بالكائنات محل الاهتمام فقط. بمجرد انتهاء إنشاء السطح ، احفظ معلمات الإنشاء وأعد استخدامها لمعالجة الصور الأخرى. لتوليد خريطة مسافة خارج سطح الميتوكوندريا الذي تم إنشاؤه، حدد سطح الميتوكوندريا في مربع شجرة المشهد.
انقر فوق معالجة الصور وحدد وظيفة الأسطح ، متبوعة بتحويل المسافة. سيظهر امتداد MATLAB الذي يطلب من المستخدم اختيار ما إذا كان يجب حساب الخريطة خارج سطح الكائن أو داخله. حدد جسم السطح الخارجي لقياس المسافة بين بقع PLA وسطح الميتوكوندريا.
بمجرد إنشاء الخريطة، تظهر كقناة جديدة في لوحة ضبط العرض. في هذه القناة ، كل بكسل له قيمة تتوافق مع المسافة إلى أقرب ميتوكوندريا. حدد البقع التي تم إنشاؤها مسبقا في مربع شجرة المشهد لقياس المسافة من كل نقطة إلى أقرب ميتوكوندريون ، وحدد وتصور أقربها.
الآن ، حدد قيما محددة وشدة مركز القناة المقابلة لخريطة المسافة في الإحصائيات والسجل التفصيلي لقياس قيمة كل مركز بقعة ، والتي تتوافق مع المسافة إلى أقرب مركز للميتوكوندريا في خريطة المسافة. قم بتصدير البيانات كملف CSV بالنقر فوق رمز القرص المرن في أسفل يسار النافذة. لاستخراج مجموعة فرعية من البقع بناء على مسافاتها إلى الميتوكوندريا ، حدد البقع في شجرة المشهد وانقر فوق علامة التبويب المرشحات.
أضف مرشحا جديدا بناء على شدة مركز القناة المقابلة لخريطة المسافة في هذه النافذة ، واستخرج البقع على بعد أقل من 380 نانومتر من الميتوكوندريا عن طريق تعيين الحد الأدنى إلى صفر ميكرومتر والعتبة العليا إلى 0.380 ميكرومتر. قم بإجراء خطوة مضاعفة بالضغط على زر تكرار التحديد إلى نقاط جديدة للتركيز على النقاط المحددة. أظهرت الصور متحدة البؤر ل ORP5-ORP8 PLA الداخلية تفاعلات في خلايا HeLa في ER الشبكي ، و ER القشري ، والمجالات الفرعية ER على اتصال وثيق مع الميتوكوندريا ، والتي يشار إليها عادة باسم أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا.
كشف تحليل التصوير ثلاثي الأبعاد أنه تم اكتشاف حوالي 50٪ من تفاعلات ORP5-ORP8 PLA الداخلية في أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا. كانت النسبة المئوية لتفاعلات ORP5-ORP8 PLA التي تحدث في أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا في الخلايا التي تفرط في التعبير عن ORP5 و ORP8 مماثلة لتلك التي لوحظت في الخلايا حيث تم التعبير عن هذه البروتينات بمستويات داخلية. أدى تخفيض ORP5 و ORP8 إلى انخفاض هائل في العدد الإجمالي لإشارات PLA ، بينما أدى الإفراط في التعبير المشترك إلى زيادة PLA.
تم الكشف عن إشارات PLA في الأزواج ORP5-PTPIP51 و ORP8-PTPIP51 ، وكان متوسط أعدادهم مشابها لزوجين ORP5-ORP8 PLA ، مما يؤكد توطين ORP5 و ORP8 في مواقع اتصال غشاء الميتوكوندريا ER. علاوة على ذلك ، يتم تحديد تفاعل ORP5-ORP8 PLA عند ملامسات غشاء البلازما ER في موقع اتصال ثلاثي الاتجاهات بين الميتوكوندريا و ER وقطرات الدهون باستخدام خلايا HeLa المنقولة باستخدام PHPLCD-RFP أو mCherry-PLN1. كما هو الحال في أي طريقة لتحليل الصور ، تعد جودة الصورة نقطة أساسية ، وبالتالي فإن تحسين الإشارة أمر حاسم للكشف التلقائي عن الكائنات.
يمكن استخدام هذه التقنية أيضا لدراسة الارتباطات بين عضيتين خلويتين أو عدة عضيات خلوية ، كما فعلنا في دراستنا الأخيرة حول وظيفة ORP5 و ORP8 في مواقع اتصال ER ثلاثية الأطراف والميتوكوندريا وقطرات الدهون. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة في دراسات أخرى في مجال الاتصال داخل الخلايا لتحديد ارتباطات جديدة متعددة الأجزاء بين العضيات.
