بروتوكولنا هو طريقة مبسطة تسمح للباحثين بتصور خطوات العدوى المبكرة من النوع البري والطفرات الفطرية الجينية دون استخدام معدات باهظة الثمن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام لوازم المختبر الأساسية للإجابة على الأسئلة البيولوجية المعقدة والفحص السريع للطفرات الفطرية لمزيد من التحليل. جزء صعب من هذه التقنية هو علاج الغمد.
الغمد عبارة عن طبقة رقيقة من الخلايا التي يمكن أن تتلف بسهولة ، لذا فإن المعالجة الدقيقة ضرورية لتجربة ناجحة. للبدء ، حدد الشعير المزروع حتى مرحلة الورقة الثانية. وباستخدام مقص معقم ، اقطع نبات الشعير فوق خط التربة مباشرة.
باستخدام ملقط ومشرط ، قم بقطع غمد الورقة الأولى المفتوحة طوليا بعناية. وباستخدام الملقط ، قم بإزالته من قاعدة الورقة الثانية. باستخدام مشرط ، اقطع معظم الورقة الأولى بعيدا عن الغمد ، ولم يتبق سوى 0.5 بوصة من أنسجة الأوراق للتركيب.
ضع الورقة الأولى بشكل مسطح في طبق بتري معقم 60 ملم يحتوي على منشفة ورقية مبللة للحفاظ على الرطوبة داخل اللوحة. قم بلصق أنسجة الأوراق على قاع طبق بتري. اختر طبق استزراع Magnaporthe oryzae البالغ من العمر تسعة إلى 12 يوما وأضف 0.5 إلى ملليلتر من الماء المعقم إليه.
باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، كشط الفطريات برفق لتحرير الكونيديا المرفقة. ماصة بعناية تعليق conidial في أنبوب الطرد المركزي microcentriguige يحتوي على قطعة صغيرة من قماش الجبن لتصفية أي قطع كبيرة من mycelium من تعليق conidial. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف تركيز الجراثيم بالماء المعقم إلى خمسة أضعاف 10 إلى رابع جراثيم لكل ملليلتر ، لأن التركيز العالي جدا يجعل تصوير مواقع العدوى الفردية أمرا صعبا.
اعتمادا على حجم الغمد ، ماصة بعناية 25 إلى 50 ميكرولتر من التعليق المخروطي داخل غمد الورقة المدرفلة. بعد ذلك ، املأ أربعة أو خمسة أكواب سعة 500 ملليلتر بالماء المقطر المزدوج وسخنها حتى تبخير. امسك غطاء طبق بتري فوق إحدى الكئوس البخارية لحبس الرطوبة داخل الطبق.
قم بتكديس ألواح غمد الأوراق المصابة وأحاطها بالأكواب الساخنة المتبقية ، لأنها تخلق بيئة رطبة ورطبة لتنبت الجراثيم. قم بحماية هذا الإعداد من الضوء من خلال تغطيته بصندوق مطاطي أو بلاستيكي بلون صلب وتركه دون إزعاج لمدة 48 ساعة أو النقطة الزمنية المطلوبة للتصوير. تحضير وصمة عار عن طريق خلط مخفف طازجا 45٪ حمض الخليك و 0.1٪ تريبان الأزرق.
Aliquot ملليلتر واحد من محلول الصبغة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. باستخدام مشرط ، قم بقطع غمد الورقة بعناية بعيدا عن الشريط. باستخدام الملقط ، ضع الغمد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتأكد من غمره بالكامل في محلول الصبغة.
اترك الأنابيب تقف لمدة ساعتين في كتلة حرارة 40 درجة مئوية أو حمام مائي حتى تخترق الصبغة الورقة. بعد ذلك ، اشطف أغلفة الأوراق بعناية ثلاث مرات في 60٪ من الجلسرين الطازج لإزالة الصبغة الإضافية. احتفظ بالغمد في الجلسرين حتى يصبح جاهزا للتركيب على الشرائح.
ضع الغمد على شريحة زجاجية نظيفة وأضف بضع قطرات من 60٪ جلسرين. باستخدام مجهر تشريح وزوجين من الملقط ، قم بفك الغمد بعناية ، وترك المركز الملقح متجها لأعلى. أمسك الغمد مفتوحا بالملقط ، ضع انزلاق الغطاء في الأعلى لمنع الغمد من التجعيد وسد موقع الإصابة.
أغلق قسيمة الغطاء باستخدام طلاء الأظافر للتخزين طويل الأجل أو التخزين قصير الأجل على الشريط. راقب الشرائح تحت مجهر ضوئي مركب. التقط صورا أساسية باستخدام هاتف ذكي عن طريق تركيب محول الهاتف الخلوي على المجهر.
بالنسبة لأجهزة Android ، اضبط إعدادات تطبيق الكاميرا على إيقاف التشغيل ، وتعطيل اللقطة العلوية ، وتعطيل الضبط التلقائي للسطوع والظلال ، وضبط دقة الصورة على كاملة. بعد تركيب الهاتف الخلوي ، التقط صورة لمقياس ميكرومتر مع الهدف المطلوب للحصول على البيانات. اضبط تكبير/تصغير الهاتف إلى 2.5 x وحافظ على تناسقه للحفاظ على حجم بكسل ثابت.
يضم مركز الغمد أكبر تركيز للجراثيم ويصيب القمعية. لذلك ، استهدف من تسع إلى 12 صورة لكل غمد للحصول على أرقام كبيرة للتحليل الإحصائي. تم تصوير مواقع الإصابة بالغلاف باستخدام محول مجهر الهاتف الذكي والهاتف الذكي بعد تلطيخه باللون الأزرق المثقب.
تعمل الحرارة وحمض الأسيتيك في عملية التلوين على تليين أنسجة الأوراق بلطف. لا يزيل الشطف بعد التلوين بنسبة 60٪ من الجلسرين البقعة الزائدة فحسب ، بل يساعد أيضا في تقليل تشتت الضوء الناجم عن الورقة وتحسين جودة الصورة. يمكن أن تؤدي الانحرافات عن بروتوكول التلوين إلى نتائج دون المستوى الأمثل ، كما هو موضح هنا.
الشعير المصاب ب 4091 نوع بري أنتج خلايا مصابة بنجاح تم تحديدها من خلال وجود خيوط مصابة داخل أنسجة غمد الأوراق. في حالة عدوى J99A الطافرة ، لوحظ تطور ناجح للضغط وأوتاد الاختراق ولكنه لم ينتج خيوط غازية. التوقيت مهم للمقايسات القائمة على العدوى.
النباتات ذات العمر المناسب والجراثيم الفطرية ضرورية للنجاح. في هذه الدراسة ، نظرنا في وجود أو عدم وجود هياكل العدوى. يمكن أن تجيب التجارب الإضافية على الأسئلة المتعلقة بالنمط الظاهري لبنية العدوى وتلك الخاصة بالخيوط الغازية.
منهجيتنا ليست جديدة ، ولكنها نسخة مبسطة ويمكن الوصول إليها من تجربة أكثر تعقيدا وتكلفة.
