Nosso protocolo é um método simplificado que permite aos pesquisadores visualizar as etapas iniciais da infecção de mutantes fúngicos selvagens e genéticos sem o uso de equipamentos caros. A principal vantagem desta técnica é o uso de suprimentos laboratoriais básicos para responder questões biológicas complexas e para a triagem rápida de mutantes fúngicos para análises posteriores. Uma parte difícil dessa técnica é o tratamento da bainha.
A bainha é uma fina camada de células que pode ser facilmente danificada, por isso o manuseio cuidadoso é essencial para um experimento bem-sucedido. Para começar, selecione a cevada cultivada até o estágio da segunda folha. E usando tesoura estéril, corte a planta de cevada logo acima da linha do solo.
Usando pinça e bisturi, corte cuidadosamente a bainha da primeira folha que é aberta longitudinalmente. E usando a pinça, retire-a da base da segunda folha. Usando um bisturi, corte a maior parte da primeira folha longe da bainha, deixando apenas 0,5 centímetros do tecido foliar para montagem.
Coloque a primeira folha plana em uma placa de Petri estéril de 60 milímetros contendo uma toalha de papel molhada para manter a umidade dentro da placa. Tape o tecido foliar no fundo da placa de Petri. Selecione uma placa de cultura Magnaporthe oryzae de nove a 12 dias e adicione 0,5 a dois mililitros de água estéril a ela.
Usando uma alça de inoculação estéril, raspe suavemente o micélio para liberar os conídios anexados. Pipetar cuidadosamente a suspensão de conídios para um tubo de microcentrífuga contendo um pequeno pedaço de pano de queijo para filtrar quaisquer pedaços grandes de micélio da suspensão de conídios. Se necessário, dilua a concentração de esporos com água estéril para cinco vezes 10 a quarto esporos por mililitro, pois uma concentração muito alta torna a obtenção de imagens de locais de infecção individuais desafiadoras.
Dependendo do tamanho da bainha, pipetar cuidadosamente 25 a 50 microlitros da suspensão conidial dentro da bainha de folha laminada. Em seguida, encha quatro ou cinco copos de 500 mililitros com água bidestilada e aqueça até cozinhar. Segure a tampa da placa de Petri sobre um dos copos fumegantes para reter a umidade dentro do prato.
Empilhe as placas de bainha de folhas infectadas e cerque-as com os copos quentes restantes, pois cria um ambiente úmido e úmido para os esporos germinarem. Proteja esta configuração da luz, cobrindo-a com uma caixa de borracha ou plástico de cor sólida e deixando-a intacta por 48 horas ou o ponto de tempo desejado para a obtenção de imagens. Prepare a mancha misturando ácido acético a 45% diluído na hora e azul de tripano a 0,1%.
Alíquota um mililitro da solução corante em tubos de microcentrífuga. Usando um bisturi, corte cuidadosamente a bainha de folhas longe da fita. Usando pinças, coloque a bainha no tubo da microcentrífuga e certifique-se de que ela esteja completamente submersa na solução do corante.
Deixe os tubos repousarem por duas horas em um bloco de calor de 40 graus Celsius ou banho-maria para que o corante penetre na folha. Em seguida, enxágue cuidadosamente as bainhas das folhas três vezes em glicerol fresco a 60% para remover o corante extra. Mantenha a bainha em glicerol até que esteja pronta para montar em lâminas.
Coloque a bainha em uma lâmina de vidro limpa e adicione algumas gotas de 60% de glicerol. Com o uso de um microscópio dissecante e dois pares de pinças, desenrole cuidadosamente a bainha, deixando o centro inoculado voltado para cima. Segurando a bainha aberta com a pinça, coloque a tampa por cima para evitar que a bainha se enrole e bloqueie o local da infecção.
Sele a tampa usando esmalte para armazenamento de longo prazo ou fita de armazenamento de curto prazo. Observe as lâminas sob um microscópio de luz composta. Tire imagens básicas com um smartphone montando um adaptador de telefone celular para o microscópio.
Para dispositivos Android, ajuste as configurações do aplicativo da câmera para piscar, desativar a foto superior, desativar o ajuste automático de brilho e sombras e definir a resolução da foto como total. Após a montagem do celular, tire uma imagem de uma balança micrômetro com o objetivo desejado para a aquisição dos dados. Ajuste o zoom do telefone para 2,5 x e mantenha-o consistente para manter um tamanho de pixel consistente.
O centro da bainha abriga a maior concentração de esporos e apressórios infectantes. Portanto, busque-se de nove a 12 imagens de cada bainha para obter números significativos para análise estatística. Os locais de infecção da bainha foram fotografados usando um adaptador de microscópio de smartphone e smartphone após coloração com azul de tripano.
O calor e o ácido acético no procedimento de coloração suavizam suavemente o tecido foliar. Os enxaguantes pós-coloração em glicerol a 60% não só removem o excesso de mancha, mas ajudam a reduzir a dispersão de luz causada pela folha e melhoram a qualidade da imagem. Desvios do protocolo de coloração podem resultar em resultados subótimos, como descrito aqui.
A cevada infectada com 4091 células silvestres produziu células infectadas com sucesso identificadas pela presença de hifas infectadas dentro do tecido da bainha foliar. No caso da infecção mutante J99A, observou-se desenvolvimento bem-sucedido de apressórios e pinos de penetração, mas não produziu hifas invasivas. O momento é importante para ensaios baseados em infecções.
Plantas adequadamente envelhecidas e esporos de fungos são essenciais para o sucesso. Neste estudo, analisamos a presença ou ausência das estruturas infecciosas. Experimentos adicionais poderiam responder a questões sobre o fenótipo da estrutura da infecção e das hifas invasoras.
Nossa metodologia não é nova, mas uma versão simplificada e acessível de um experimento mais complexo e caro.
