使用基本显微镜和智能手机可视化大麦（大麦）稻瘟病（稻瘟病）的早期感染部位

我们的协议是一种简化的方法，允许研究人员可视化野生型和遗传真菌突变体的早期感染步骤，而无需使用昂贵的设备。该技术的主要优点是使用基本的实验室用品来回答复杂的生物学问题，并用于快速筛选真菌突变体以进行进一步分析。这种技术的困难部分是鞘的处理。

鞘是一层薄薄的细胞，很容易被损坏，因此小心处理对于成功的实验至关重要。首先，选择生长到第二个叶期的大麦。并使用无菌剪刀，将大麦植株剪在土壤线上方。

使用镊子和手术刀，小心地切开纵向打开的第一片叶子的鞘。然后用镊子将其从第二片叶子的基部取出。使用手术刀，将第一片叶子的大部分从鞘中切开，只留下 0.5 英寸的叶组织用于安装。

将第一片叶子平放在含有湿纸巾的无菌60毫米培养皿中，以保持板内的湿度。将叶组织粘在培养皿的底部。选择一个9至12天的Magnaporthe oryzae培养板，并向其中加入0.5至2毫升无菌水。

使用无菌接种环，轻轻刮擦菌丝体以释放附着的分生孢子。小心地将分生孢子悬浮液移入装有一小块奶酪布的微量离心管中，以过滤掉分生孢子悬浮液中的任何大块菌丝体。如有必要，用无菌水将孢子浓度稀释至每毫升10至第四个孢子的五倍，因为浓度过高会使单个感染部位成像具有挑战性。

根据鞘的大小，小心地将25至50微升的分生孢子悬浮液移入卷起的叶鞘内。接下来，用双蒸水填充四五个 500 毫升烧杯并加热直至蒸熟。将培养皿的盖子放在其中一个蒸气腾腾的烧杯上，以将水分困在板内。

堆叠受感染的叶鞘板，并用剩余的热烧杯包围它们，因为它为孢子发芽创造了一个潮湿的环境。用纯色橡胶或塑料盒覆盖此设置，使其不受干扰48小时或所需的成像时间点，从而保护该装置免受光照。通过混合新鲜稀释的45%乙酸和0.1%台盼蓝来制备染色剂。

将一毫升染料溶液等分到微量离心管中。使用手术刀，小心地将叶鞘从胶带上切开。使用镊子将鞘放入微量离心管中，并确保其完全浸没在染料溶液中。

让试管在 40 摄氏度的加热块或水浴中静置两个小时，以使染料穿透叶子。接下来，用60%新鲜甘油小心地冲洗叶鞘三次，以去除多余的染料。将护套保持在甘油中，直到准备好安装在载玻片上。

将护套放在干净的载玻片上，加入几滴60%甘油。使用解剖显微镜和两对镊子，小心地展开鞘，使接种的中心朝上。用镊子打开鞘，将盖玻片放在顶部，以防止鞘卷曲并阻塞感染部位。

使用指甲油密封盖玻片，以便长期存放或胶带短期存放。在复合光学显微镜下观察载玻片。通过将手机适配器安装到显微镜上，使用智能手机拍摄基本图像。

对于Android设备，将相机应用程序设置调整为闪光灯关闭，禁用顶部拍摄，禁用亮度和阴影的自动调整，并将照片分辨率设置为完整。安装手机后，拍摄刻度千分尺的图像，以获取数据所需的物镜。将手机的变焦调整为 2.5 倍并保持一致，以保持一致的像素大小。

鞘的中心容纳了最大浓度的孢子和感染性螘。因此，目标是每个护套的 9 到 12 张图像，以获得用于统计分析的有效数字。用台盼蓝染色后，使用智能手机和智能手机显微镜适配器对鞘的感染部位进行成像。

染色过程中的热量和乙酸会温和地软化叶子组织。染色后用60%甘油冲洗不仅可以去除多余的污渍，还可以减少叶片引起的光散射并提高图像质量。与染色方案的偏差可能导致次优结果，如此处所述。

感染4091野生型的大麦产生成功感染的细胞，通过叶鞘组织内存在感染菌丝来鉴定。在突变型J99A感染的情况下，注意到压迫症和穿透钉的成功发展，但没有产生侵袭性菌丝。时机对于基于感染的检测很重要。

适当老化的植物和真菌孢子对于成功至关重要。在这项研究中，我们研究了感染结构的存在与否。其他实验可以回答有关感染结构表型和入侵菌丝表型的问题。

我们的方法并不新鲜，而是更复杂、更昂贵的实验的简化、可访问版本。