Unser Protokoll ist eine vereinfachte Methode, die es Forschern ermöglicht, frühe Infektionsschritte von Wildtyp- und genetischen Pilzmutanten ohne den Einsatz teurer Geräte zu visualisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von grundlegendem Labormaterial zur Beantwortung komplexer biologischer Fragestellungen und zum schnellen Screening von Pilzmutanten für weitere Analysen. Ein schwieriger Teil dieser Technik ist die Behandlung der Scheide.
Die Hülle ist eine dünne Schicht von Zellen, die leicht beschädigt werden kann, daher ist eine sorgfältige Handhabung für ein erfolgreiches Experiment unerlässlich. Wählen Sie zunächst die Gerste aus, die bis zum zweiten Blattstadium angebaut wird. Schneiden Sie die Gerstenpflanze mit einer sterilen Schere knapp über der Bodenlinie ab.
Schneiden Sie mit einer Pinzette und einem Skalpell vorsichtig die Hülle des ersten Blattes ab, das in Längsrichtung geöffnet ist. Entfernen Sie es mit der Pinzette von der Basis des zweiten Blattes. Schneiden Sie mit einem Skalpell den größten Teil des ersten Blattes von der Scheide ab und lassen Sie nur 0,5 Zoll des Blattgewebes für die Montage übrig.
Legen Sie das erste Blatt flach in eine sterile 60-Millimeter-Petrischale, die ein feuchtes Papiertuch enthält, um die Luftfeuchtigkeit im Inneren des Tellers aufrechtzuerhalten. Kleben Sie das Blattgewebe auf den Boden der Petrischale. Wählen Sie eine neun bis 12 Tage alte Magnaporthe oryzae-Kulturplatte und fügen Sie 0,5 bis zwei Milliliter steriles Wasser hinzu.
Kratzen Sie das Myzel mit einer sterilen Impfschleife vorsichtig ab, um die anhaftenden Konidien freizusetzen. Pipettieren Sie die Konidiensuspension vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das ein kleines Stück Käsetuch enthält, um große Myzelstücke aus der Konidiensuspension herauszufiltern. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Sporenkonzentration mit sterilem Wasser auf das Fünffache 10 bis zur vierten Spore pro Milliliter, da eine zu hohe Konzentration die Bildgebung einzelner Infektionsstellen erschwert.
Je nach Mantelgröße 25 bis 50 Mikroliter der konidialen Suspension vorsichtig in die gerollte Blattscheide pipettieren. Als nächstes füllen Sie vier oder fünf 500-Milliliter-Becher mit doppelt destilliertem Wasser und erhitzen bis zum Dämpfen. Halten Sie den Deckel der Petrischale über einen der dampfenden Becher, um die Feuchtigkeit im Inneren des Tellers einzufangen.
Stapeln Sie die infizierten Blattscheidenplatten und umgeben Sie sie mit den verbleibenden heißen Bechern, da dies eine feuchte, feuchte Umgebung für die Keimung der Sporen schafft. Schützen Sie dieses Setup vor Licht, indem Sie es mit einer einfarbigen Gummi- oder Plastikbox abdecken und es 48 Stunden oder den gewünschten Zeitpunkt für die Bildgebung ungestört lassen. Bereiten Sie den Fleck vor, indem Sie frisch verdünnte 45% Essigsäure und 0,1% Trypanblau mischen.
Aliquotieren Sie einen Milliliter der Farbstofflösung in Mikrozentrifugenröhrchen. Schneiden Sie die Blattscheide mit einem Skalpell vorsichtig vom Klebeband ab. Legen Sie die Hülle mit einer Pinzette in das Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass sie vollständig in die Farbstofflösung eingetaucht ist.
Lassen Sie die Röhrchen zwei Stunden in einem 40 Grad Celsius heißen Heizblock oder Wasserbad stehen, damit der Farbstoff in das Blatt eindringen kann. Als nächstes spülen Sie die Blattscheiden dreimal vorsichtig mit 60% frischem Glycerin ab, um den zusätzlichen Farbstoff zu entfernen. Bewahren Sie die Hülle in Glycerin auf, bis sie auf Objektträgern montiert werden kann.
Legen Sie die Hülle auf einen sauberen Objektträger und fügen Sie ein paar Tropfen 60% Glycerin hinzu. Rollen Sie die Hülle mit einem Präpariermikroskop und zwei Pinzetten vorsichtig ab und lassen Sie die geimpfte Mitte nach oben zeigen. Halten Sie die Hülle mit der Pinzette offen und legen Sie das Deckglas darauf, um zu verhindern, dass sich die Hülle kräuselt und die Infektionsstelle blockiert.
Verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack für die Langzeitlagerung oder Klebeband für die Kurzzeitlagerung. Beobachten Sie die Objektträger unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop. Nehmen Sie einfache Bilder mit einem Smartphone auf, indem Sie einen Handyadapter an das Mikroskop anschließen.
Passen Sie bei Android-Geräten die Einstellungen der Kameraanwendung so an, dass sie ausgeschaltet sind, deaktivieren Sie die obere Aufnahme, deaktivieren Sie die automatische Anpassung von Helligkeit und Schatten und stellen Sie die Fotoauflösung auf voll ein. Machen Sie nach der Montage des Mobiltelefons ein Bild eines Mikrometers mit einem gewünschten Ziel für die Erfassung der Daten. Stellen Sie den Zoom des Telefons auf das 2,5-fache ein und halten Sie ihn konsistent, um eine konsistente Pixelgröße beizubehalten.
Das Zentrum der Hülle beherbergt die größte Konzentration von Sporen und infizierenden Appressorien. Streben Sie daher neun bis 12 Bilder jeder Hülle an, um signifikante Zahlen für die statistische Analyse zu erhalten. Die Infektionsstellen der Hülle wurden nach der Färbung mit Trypanblau mit einem Smartphone und einem Smartphone-Mikroskopadapter abgebildet.
Durch die Hitze und Essigsäure beim Färben wird das Blattgewebe sanft aufgeweicht. Die Nachfärbespülungen in 60% Glycerin entfernen nicht nur den überschüssigen Fleck, sondern tragen auch dazu bei, die durch das Blatt verursachte Lichtstreuung zu reduzieren und die Bildqualität zu verbessern. Abweichungen vom Färbeprotokoll können zu suboptimalen Ergebnissen führen, wie hier dargestellt.
Gerste, die mit 4091 Wildtyp infiziert war, produzierte erfolgreich infizierte Zellen, die durch das Vorhandensein infizierter Hyphen im Blattscheidengewebe identifiziert wurden. Im Fall der mutierten J99A-Infektion wurde eine erfolgreiche Entwicklung von Appressorien und Penetrationsstiften festgestellt, die jedoch keine invasiven Hyphen hervorbrachten. Das Timing ist wichtig für infektionsbasierte Assays.
Entsprechend gealterte Pflanzen und Pilzsporen sind entscheidend für den Erfolg. In dieser Studie haben wir das Vorhandensein oder Fehlen der Infektionsstrukturen untersucht. Zusätzliche Experimente könnten Fragen zum Phänotyp der Infektionsstruktur und der eindringenden Hyphen beantworten.
Unsere Methodik ist nicht neu, sondern eine vereinfachte, zugängliche Version eines komplexeren, teureren Experiments.
