Наш протокол представляет собой упрощенный метод, который позволяет исследователям визуализировать ранние стадии заражения дикого типа и генетических грибковых мутантов без использования дорогостоящего оборудования. Основным преимуществом этого метода является использование основных лабораторных принадлежностей для ответа на сложные биологические вопросы и для быстрого скрининга грибковых мутантов для дальнейшего анализа. Сложной частью этой техники является обработка ножен.
Оболочка представляет собой тонкий слой клеток, которые можно легко повредить, поэтому для успешного эксперимента необходимо осторожное обращение. Для начала выберите ячмень, выращенный до стадии второго листа. И стерильными ножницами срежьте растение ячменя чуть выше линии почвы.
С помощью щипцов и скальпеля аккуратно срежьте продольно открытую в продольном направлении оболочку первого листа. И с помощью щипцов удалите его с основания второго листа. Используя скальпель, отрежьте большую часть первого листа от оболочки, оставив только 0,5 дюйма ткани листа для крепления.
Поместите первый лист в стерильную 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую влажное бумажное полотенце, чтобы поддерживать влажность внутри тарелки. Приклейте листовую ткань ко дну чашки Петри. Выберите культуральную тарелку Magnaporthe oryzae возрастом от девяти до 12 дней и добавьте в нее от 0,5 до двух миллилитров стерильной воды.
Используя стерильную петлю для инокуляции, аккуратно соскребите мицелий, чтобы освободить прикрепленные конидии. Осторожно поместите конидиальную суспензию пипеткой в микроцентрифужную пробирку, содержащую небольшой кусочек сырной ткани, чтобы отфильтровать любые крупные кусочки мицелия из конидиальной суспензии. При необходимости разбавьте концентрацию спор стерильной водой до пяти раз от 10 до четверти спор на миллилитр, так как слишком высокая концентрация затрудняет визуализацию отдельных участков инфекции.
В зависимости от размера оболочки осторожно насыпьте пипеткой от 25 до 50 микролитров конидиальной суспензии внутрь свернутой листовой оболочки. Затем наполните четыре или пять стаканов по 500 миллилитров двойной дистиллированной водой и нагрейте до приготовления на пару. Держите крышку чашки Петри над одним из дымящихся стаканов, чтобы улавливать влагу внутри тарелки.
Сложите зараженные пластины листовой оболочки и окружите их оставшимися горячими стаканами, так как это создает влажную и влажную среду для прорастания спор. Защитите эту установку от света, накрыв ее сплошной цветной резиновой или пластиковой коробкой и оставив ее нетронутой на 48 часов или желаемый момент времени для получения изображения. Приготовьте пятно, смешав свежеразбавленную 45%-ную уксусную кислоту и 0,1%-ную трипановую синюю.
Аликвотируйте один миллилитр раствора красителя в микроцентрифужные пробирки. С помощью скальпеля аккуратно отрежьте листовую оболочку от ленты. Используя щипцы, поместите оболочку в микроцентрифужную трубку и убедитесь, что она полностью погружена в раствор красителя.
Дайте тюбикам постоять два часа в тепловом блоке с температурой 40 градусов Цельсия или на водяной бане, чтобы краситель проник в лист. Затем тщательно промойте оболочки листьев три раза в 60% свежем глицерине, чтобы удалить лишний краситель. Держите оболочку в глицерине до тех пор, пока она не будет готова к установке на предметные стекла.
Поместите оболочку на чистое предметное стекло и добавьте несколько капель 60% глицерина. С помощью рассекающего микроскопа и двух пар щипцов осторожно разверните оболочку, оставив инокулированный центр лицевой стороной вверх. Удерживая ножны открытыми щипцами, положите сверху чехол, чтобы влагалища не скручивались и не блокировали место заражения.
Запечатайте покровный лист лаком для ногтей для длительного хранения или лентой кратковременного хранения. Наблюдайте за предметными стеклами под составным световым микроскопом. Делайте основные изображения с помощью смартфона, установив адаптер сотового телефона на микроскоп.
Для устройств Android отрегулируйте настройки приложения камеры так, чтобы он выключился, отключите верхний снимок, отключите автоматическую регулировку яркости и теней и установите полное разрешение фотографии. После установки сотового телефона сделайте снимок масштабного микрометра с желаемой целью получения данных. Отрегулируйте масштаб телефона до 2,5 x и сохраняйте его постоянным, чтобы поддерживать постоянный размер пикселя.
В центре оболочки находится наибольшая концентрация спор и заражающих аппрессориев. Поэтому стремитесь к девяти-12 изображениям каждой оболочки, чтобы получить значимые числа для статистического анализа. Места заражения оболочки были визуализированы с помощью смартфона и адаптера микроскопа смартфона после окрашивания трипановым синим.
Тепло и уксусная кислота в процедуре окрашивания мягко смягчают ткань листа. Ополаскиватели после окрашивания с содержанием 60% глицерина не только удаляют излишки пятен, но и помогают уменьшить рассеивание света, вызванное листом, и улучшить качество изображения. Отклонения от протокола окрашивания могут привести к неоптимальным результатам, как показано здесь.
Ячмень, зараженный 4091 диким типом, продуцировал успешно инфицированные клетки, идентифицированные по наличию инфицированных гиф внутри ткани оболочки листа. В случае мутантной инфекции J99A было замечено успешное развитие аппрессорий и пенетрационных колышков, но они не продуцировали инвазивные гифы. Время важно для анализов, основанных на инфекции.
Правильно выдержанные растения и грибковые споры необходимы для успеха. В этом исследовании мы рассмотрели наличие или отсутствие инфекционных структур. Дополнительные эксперименты могут ответить на вопросы, касающиеся фенотипа структуры инфекции и структуры вторжения гиф.
Наша методика не нова, а является упрощенной, доступной версией более сложного и дорогостоящего эксперимента.
