הפרוטוקול שלנו הוא שיטה פשוטה המאפשרת לחוקרים לדמיין שלבי הדבקה מוקדמים של מוטנטים פטרייתיים מסוג בר וגנטי ללא שימוש בציוד יקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בציוד מעבדה בסיסי כדי לענות על שאלות ביולוגיות מורכבות ולסינון מהיר של מוטנטים פטרייתיים לניתוח נוסף. חלק קשה של טכניקה זו היא הטיפול של הנדן.
הנדן הוא שכבה דקה של תאים שיכולים להינזק בקלות, ולכן טיפול זהיר חיוני לניסוי מוצלח. כדי להתחיל, לבחור את השעורה גדל עד שלב העלה השני. ובאמצעות מספריים סטריליים, חותכים את צמח השעורה ממש מעל קו הקרקע.
בעזרת מלקחיים ואזמל, חותכים בזהירות את נדן העלה הראשון הפתוח לאורך. ובאמצעות המלקחיים, להסיר אותו מבסיס העלה השני. בעזרת אזמל, חותכים את רוב העלה הראשון הרחק מהנדן, ומשאירים רק 0.5 אינץ' מרקמת העלה להרכבה.
הניחו את העלה הראשון שטוח בכלי פטרי סטרילי בקוטר 60 מ"מ המכיל מגבת נייר רטובה כדי לשמור על לחות בתוך הצלחת. הדביקו את רקמת העלה לתחתית צלחת הפטרי. בחרו צלחת תרבית Magnaporthe oryzae בת תשעה עד 12 ימים והוסיפו לה 0.5 עד שני מיליליטר מים סטריליים.
בעזרת לולאת חיסון סטרילית, מגרדים בעדינות את התפטיר כדי לשחרר את הקונידיה. בזהירות פיפטה את התרחיף conidial לתוך צינור microcentrifuge המכיל חתיכת קטנה של בד גבינה כדי לסנן כל חתיכות גדולות של תפטיר מן התרחיף conidial. במידת הצורך, דללו את ריכוז הנבגים במים סטריליים לחמש פעמים 10 עד לנבג הרביעי למיליליטר, מכיוון שריכוז גבוה מדי הופך את הדמיה של אתרי זיהום בודדים למאתגרת.
בהתאם לגודל הנדן, בזהירות פיפטה 25 עד 50 מיקרוליטר של ההשעיה conidial בתוך נדן עלה מגולגל. לאחר מכן, ממלאים ארבע או חמש כוסות 500 מיליליטר במים מזוקקים כפול ומחממים עד לאידוי. החזיקו את מכסה צלחת הפטרי מעל אחת הכוסות המהבילות כדי ללכוד לחות בתוך הצלחת.
ערמו את צלחות נדן העלים הנגועות והקיפו אותן בכוסות החמות שנותרו, מכיוון שזה יוצר סביבה לחה ולחה לנבגים לנבוט. הגן על מערך זה מפני אור על ידי כיסויו בקופסת גומי או פלסטיק בצבע אחיד והשארתו ללא הפרעה למשך 48 שעות או נקודת הזמן הרצויה להדמיה. הכינו את הכתם על ידי ערבוב 45% חומצה אצטית מדוללת טרייה ו-0.1% טריפאן כחול.
Aliquot מיליליטר אחד של תמיסת הצבע לתוך צינורות microcentrifuge. בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את נדן העלה מהקלטת. בעזרת מלקחיים, הכניסו את הנדן לצינור המיקרוצנטריפוגה וודאו שהוא שקוע לחלוטין בתמיסת הצבע.
הניחו לצינורות לעמוד במשך שעתיים בבלוק חום של 40 מעלות צלזיוס או באמבט מים כדי שהצבע יחדור לעלה. לאחר מכן, שטפו בזהירות את נדן העלה שלוש פעמים בגליצרול טרי 60% כדי להסיר את הצבע העודף. יש לשמור את הנדן בגליצרול עד שיהיה מוכן להרכבה על מגלשות.
הניחו את הנדן על מגלשת זכוכית נקייה והוסיפו כמה טיפות של 60% גליצרול. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ושני זוגות מלקחיים, פותחים בזהירות את הנדן ומשאירים את המרכז המחוסן פונה כלפי מעלה. מחזיקים את הנדן פתוח עם המלקחיים, מניחים את החלקת הכיסוי למעלה כדי למנוע מהנדן להסתלסל ולחסום את אתר הזיהום.
אטמו את חלקת הכיסוי באמצעות לק לאחסון לטווח ארוך או סרט אחסון לטווח קצר. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ אור מורכב. צלם תמונות בסיסיות באמצעות טלפון חכם על-ידי הרכבת מתאם טלפון סלולרי למיקרוסקופ.
עבור מכשירי Android, התאם את הגדרות יישום המצלמה כדי להבהב, השבת את התמונה העליונה, השבת את הכוונון האוטומטי של בהירות וצללים והגדר את רזולוציית התמונה למלאה. לאחר הרכבת הטלפון הסלולרי, צלם תמונה של מיקרומטר בקנה מידה עם מטרה רצויה לרכישת הנתונים. כוונן את זום הטלפון ל- 2.5x ושמור על עקביות כדי לשמור על גודל פיקסלים עקבי.
במרכז הנדן נמצא הריכוז הגדול ביותר של נבגים ומפרשים מזהמים. לכן, יש לשאוף לתשע עד 12 תמונות של כל נדן כדי לקבל מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. אתרי ההדבקה של הנדן צולמו באמצעות טלפון חכם ומתאם מיקרוסקופ סמארטפון לאחר צביעה בכחול טריפאן.
החום והחומצה האצטית בתהליך הצביעה מרככים את רקמת העלה בעדינות. השטיפות לאחר הצביעה בגליצרול 60% לא רק מסירות את הכתם העודף, אלא גם מסייעות להפחית את פיזור האור שנגרם על ידי העלה ולשפר את איכות התמונה. סטיות מפרוטוקול הצביעה עלולות לגרום לתוצאות לא אופטימליות, כפי שמתואר כאן.
שעורה נגועה בסוג בר 4091 ייצרה תאים נגועים בהצלחה שזוהו על ידי נוכחות של קורים נגועים בתוך רקמת מעטפת העלה. במקרה של זיהום J99A מוטנטי, התפתחות מוצלחת של יתדות אפרסוריה וחדירה הבחינו אך לא יצרו קורים פולשניים. העיתוי חשוב לבדיקות מבוססות זיהום.
צמחים מיושנים כראוי ונבגי פטריות חיוניים להצלחה. במחקר זה הסתכלנו על נוכחות או היעדר מבני הזיהום. ניסויים נוספים יכולים לענות על שאלות לגבי הפנוטיפ של מבנה הזיהום ושל הקורים הפולשים.
המתודולוגיה שלנו אינה חדשה, אלא גרסה פשוטה ונגישה של ניסוי מורכב ויקר יותר.
