私たちのプロトコルは、研究者が高価な機器を使用せずに野生型および遺伝的真菌変異体の早期感染ステップを視覚化できるようにする簡単な方法です。この技術の主な利点は、複雑な生物学的質問に答えるための基本的な実験用品の使用、およびさらなる分析のための真菌変異体の迅速なスクリーニングです。この技術の難しい部分は、シースの処理です。
シースは細胞の薄い層であり、損傷しやすいため、実験を成功させるには慎重な取り扱いが不可欠です。はじめに、2番目の葉の段階まで成長した大麦を選択します。そして、滅菌ハサミを使用して、土壌線のすぐ上で大麦植物を切ります。
鉗子とメスを使用して、縦方向に開いている最初の葉の鞘を慎重に切ります。そして鉗子を使って、2枚目の葉の付け根からそれを取り除きます。メスを使用して、最初の葉の大部分を鞘から切り取り、取り付け用の葉組織を0.5インチだけ残します。
プレート内の湿度を維持するために、濡れたペーパータオルを含む滅菌済みの60ミリメートルのペトリ皿に最初の葉を平らに置きます。葉の組織をペトリ皿の底にテープで留めます。9〜12日齢のマグナポルテオリゼ培養プレートを選択し、0.5〜2ミリリットルの滅菌水を加えます。
滅菌接種ループを使用して、菌糸体を静かにこすり、付着した分生子を解放します。分生子懸濁液をチーズクロスの小片を含む微小遠心チューブに注意深くピペットで入れ、分生子懸濁液から大きな菌糸体をろ過します。必要に応じて、胞子濃度を滅菌水で1ミリリットルあたり10〜4番目の胞子の5倍に希釈します。
シースのサイズに応じて、ロールリーフシースの内側に25〜50マイクロリットルの分生子懸濁液を慎重にピペットで入れます。次に、4〜5個の500ミリリットルビーカーに二重蒸留水を入れ、蒸すまで加熱します。ペトリ皿の蓋を蒸しビーカーの1つにかざして、プレート内の湿度を閉じ込めます。
感染した葉鞘プレートを積み重ね、胞子が発芽するための湿った湿った環境を作り出すため、残りの熱いビーカーで囲みます。このセットアップを無地のゴムまたはプラスチックの箱で覆い、48時間またはイメージングに必要な時点まで邪魔されないようにして、このセットアップを光から保護します。新たに希釈した45%酢酸と0.1%トリパンブルーを混ぜて染みを準備します。
1ミリリットルの色素溶液を微量遠心チューブに分注します。メスを使用して、葉鞘をテープから慎重に切り取ります。鉗子を使用して、シースをマイクロ遠心チューブに入れ、染料溶液に完全に沈んでいることを確認します。
染料が葉に浸透するように、チューブを摂氏40度のヒートブロックまたは水浴に2時間放置します。次に、葉鞘を60%新鮮なグリセロールで3回慎重にすすぎ、余分な染料を取り除きます。スライドに取り付ける準備ができるまで、シースをグリセロールに保ちます。
シースをきれいなスライドガラスの上に置き、60%グリセロールを数滴加えます。解剖顕微鏡と2対の鉗子を使用して、接種した中心を上に向けて慎重に鞘を広げます。鉗子でシースを開いたまま、カバースリップを上に置いて、シースがカールして感染部位を塞ぐのを防ぎます。
長期保管の場合はマニキュア、短期保管の場合はテープを使用してカバースリップをシールします。複合光学顕微鏡でスライドを観察します。携帯電話のアダプターを顕微鏡に取り付けて、スマートフォンで基本的な画像を撮ります。
Androidデバイスの場合は、カメラアプリケーション設定を調整してフラッシュオフし、トップショットを無効にし、明るさと影の自動調整を無効にして、写真の解像度を最大に設定します。携帯電話を取り付けた後、データを取得するための目的のスケールマイクロメータの画像を撮影します。携帯電話のズームを2.5倍に調整し、一貫したピクセルサイズを維持するために一貫性を保ちます。
鞘の中心には、胞子と感染する付着器が最も集中しています。したがって、統計分析のために有意な数を得るために、各シースの9〜12枚の画像を目指します。鞘の感染部位をトリパンブルーで染色した後、スマートフォンとスマートフォンの顕微鏡アダプターを使用して画像化しました。
染色手順の熱と酢酸は、葉の組織を穏やかに柔らかくします。60%グリセロールでの染色後のすすぎは、余分な汚れを取り除くだけでなく、葉によって引き起こされる光散乱を減らし、画質を向上させるのに役立ちます。染色プロトコルからの逸脱は、ここに示すように、最適ではない結果をもたらす可能性があります。
4091野生型に感染したオオムギは、葉鞘組織内の感染した菌糸の存在によって識別される感染細胞を首尾よく産生した。変異型J99A感染の場合、付着器と浸透ペグの開発に成功しましたが、侵襲性菌糸は生成されませんでした。タイミングは感染ベースのアッセイにとって重要です。
適切に熟成された植物と真菌胞子は成功に不可欠です。本研究では、感染構造の有無を調べた。追加の実験は、感染構造の表現型と侵入する菌糸の表現型に関する質問に答えることができます。
私たちの方法論は新しいものではありませんが、より複雑で費用のかかる実験の単純化されたアクセス可能なバージョンです。
