Il nostro protocollo è un metodo semplificato che consente ai ricercatori di visualizzare le prime fasi di infezione dei mutanti fungini selvatici e genetici senza l'uso di costose attrezzature. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di forniture di laboratorio di base per rispondere a domande biologiche complesse e per lo screening rapido di mutanti fungini per ulteriori analisi. Una parte difficile di questa tecnica è il trattamento della guaina.
La guaina è un sottile strato di cellule che può essere facilmente danneggiato, quindi un'attenta manipolazione è essenziale per un esperimento di successo. Per iniziare, seleziona l'orzo coltivato fino alla seconda fase fogliare. E usando le forbici sterili, tagliare la pianta d'orzo appena sopra la linea del terreno.
Usando una pinza e un bisturi, tagliare con cura la guaina della prima foglia aperta longitudinalmente. E usando la pinza, rimuovilo dalla base della seconda foglia. Usando un bisturi, tagliare la maggior parte della prima foglia dalla guaina, lasciando solo 0,5 pollici di tessuto fogliare per il montaggio.
Posizionare la prima foglia piatta in una piastra di Petri sterile da 60 millimetri contenente un tovagliolo di carta bagnato per mantenere l'umidità all'interno della piastra. Fissare il tessuto fogliare sul fondo della capsula di Petri. Selezionare una piastra di coltura Magnaporthe oryzae di nove a 12 giorni e aggiungere da 0,5 a due millilitri di acqua sterile.
Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, raschiare delicatamente i miceli per rilasciare i conidi attaccati. Pipettare accuratamente la sospensione condiale in un tubo di microcentrifuga contenente un piccolo pezzo di panno di formaggio per filtrare eventuali pezzi grandi di micelio dalla sospensione condiale. Se necessario, diluire la concentrazione di spore con acqua sterile a cinque volte 10 alla quarta spora per millilitro, poiché una concentrazione troppo elevata rende difficile l'imaging dei singoli siti di infezione.
A seconda delle dimensioni della guaina, pipettare accuratamente da 25 a 50 microlitri della sospensione condiorale all'interno della guaina fogliare arrotolata. Quindi, riempire quattro o cinque becher da 500 millilitri con acqua distillata doppia e riscaldare fino alla cottura a vapore. Tenere il coperchio della capsula di Petri su uno dei bicchieri fumanti per intrappolare l'umidità all'interno della piastra.
Impilare le piastre della guaina fogliare infette e circondarle con i becher caldi rimanenti, poiché crea un ambiente umido e umido per la germinazione delle spore. Proteggi questa configurazione dalla luce coprendola con una scatola di gomma o plastica colorata e lasciandola indisturbata per 48 ore o il punto temporale desiderato per l'imaging. Preparare la macchia mescolando acido acetico 45% appena diluito e 0,1% blu tripano.
Aliquot un millilitro della soluzione colorante in provette da microcentrifuga. Usando un bisturi, tagliare con cura la guaina fogliare lontano dal nastro. Utilizzando una pinza, posizionare la guaina nel tubo della microcentrifuga e assicurarsi che sia completamente immersa nella soluzione colorante.
Lasciare riposare i tubi per due ore in un blocco di calore di 40 gradi Celsius o a bagnomaria affinché il colorante penetri nella foglia. Quindi, sciacquare accuratamente le guaine fogliari tre volte in glicerolo fresco al 60% per rimuovere il colorante in eccesso. Tenere la guaina in glicerolo fino al momento del montaggio sui vetrini.
Posizionare la guaina su un vetrino pulito e aggiungere alcune gocce di glicerolo al 60%. Utilizzando un microscopio da dissezione e due paia di pinze, srotolare con cura la guaina, lasciando il centro inoculato rivolto verso l'alto. Tenendo la guaina aperta con la pinza, posizionare la linguetta di copertura sulla parte superiore per evitare che la guaina si arricci e blocchi il sito di infezione.
Sigillare la copertina utilizzando lo smalto per unghie per la conservazione a lungo termine o la conservazione a breve termine del nastro. Osservare i vetrini al microscopio ottico composto. Scatta immagini di base con uno smartphone montando un adattatore per telefono cellulare al microscopio.
Per i dispositivi Android, regolare le impostazioni dell'applicazione della fotocamera in modo che lampeggino, disabilitare lo scatto dall'alto, disabilitare la regolazione automatica della luminosità e delle ombre e impostare la risoluzione della foto su massima. Dopo aver montato il telefono cellulare, scattare un'immagine di un micrometro in scala con un obiettivo desiderato per l'acquisizione dei dati. Regola lo zoom del telefono a 2,5x e mantienilo coerente per mantenere una dimensione in pixel coerente.
Il centro della guaina ospita la più grande concentrazione di spore e appressorie infettanti. Pertanto, mirare a nove a 12 immagini di ogni guaina per ottenere numeri significativi per l'analisi statistica. I siti di infezione della guaina sono stati ripresi utilizzando uno smartphone e un adattatore per microscopio per smartphone dopo la colorazione con tripano blu.
Il calore e l'acido acetico nella procedura di colorazione ammorbidiscono delicatamente il tessuto fogliare. I risciacqui post-colorazione in glicerolo al 60% non solo rimuovono la macchia in eccesso, ma aiutano a ridurre la dispersione della luce causata dalla foglia e migliorano la qualità dell'immagine. Le deviazioni dal protocollo di colorazione possono portare a risultati non ottimali, come illustrato qui.
L'orzo infettato con 4091 wild type ha prodotto con successo cellule infette identificate dalla presenza di ife infette all'interno del tessuto della guaina fogliare. Nel caso dell'infezione mutante da J99A, è stato notato uno sviluppo riuscito di appressoria e pioli di penetrazione, ma non ha prodotto ife invasive. La tempistica è importante per i test basati sulle infezioni.
Piante opportunamente invecchiate e spore fungine sono essenziali per il successo. In questo studio, abbiamo esaminato la presenza o l'assenza delle strutture di infezione. Ulteriori esperimenti potrebbero rispondere a domande riguardanti il fenotipo della struttura dell'infezione e quello delle ife invasori.
La nostra metodologia non è nuova, ma una versione semplificata e accessibile di un esperimento più complesso e costoso.
