Notre protocole est une méthode simplifiée qui permet aux chercheurs de visualiser les étapes précoces de l’infection de mutants fongiques de type sauvage et génétique sans utiliser d’équipement coûteux. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de fournitures de laboratoire de base pour répondre à des questions biologiques complexes et pour le dépistage rapide des mutants fongiques pour une analyse plus approfondie. Une partie difficile de cette technique est le traitement de la gaine.
La gaine est une fine couche de cellules qui peut être facilement endommagée, une manipulation prudente est donc essentielle pour une expérience réussie. Pour commencer, sélectionnez l’orge cultivée jusqu’au deuxième stade foliaire. Et à l’aide de ciseaux stériles, coupez le plant d’orge juste au-dessus de la ligne du sol.
À l’aide d’une pince et d’un scalpel, coupez soigneusement la gaine de la première feuille ouverte longitudinalement. Et à l’aide de la pince, retirez-la de la base de la deuxième feuille. À l’aide d’un scalpel, coupez la majeure partie de la première feuille loin de la gaine, ne laissant que 0,5 pouce de tissu foliaire pour le montage.
Placez la première feuille à plat dans une boîte de Petri stérile de 60 millimètres contenant une serviette en papier humide pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la plaque. Collez le tissu foliaire au fond de la boîte de Pétri. Choisissez une plaque de culture Magnaporthe oryzae âgée de neuf à 12 jours et ajoutez-y 0,5 à deux millilitres d’eau stérile.
À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, grattez doucement le mycélium pour libérer les conidies attachées. Pipeter soigneusement la suspension conidiale dans un tube microcentrifuge contenant un petit morceau de tissu à fromage pour filtrer les gros morceaux de mycélium de la suspension conidiale. Si nécessaire, diluez la concentration de spores avec de l’eau stérile à cinq fois 10 à la quatrième spores par millilitre, car une concentration trop élevée rend difficile l’imagerie des sites d’infection individuels.
Selon la taille de la gaine, pipeter soigneusement 25 à 50 microlitres de la suspension conidiale à l’intérieur de la gaine à feuilles roulées. Ensuite, remplissez quatre ou cinq béchers de 500 millilitres avec de l’eau distillée double et chauffez jusqu’à cuisson à la vapeur. Tenez le couvercle de la boîte de Petri sur l’un des béchers fumants pour emprisonner l’humidité à l’intérieur de la plaque.
Empilez les plaques de gaine de feuilles infectées et entourez-les des béchers chauds restants, car cela crée un environnement humide et humide pour la germination des spores. Protégez cette configuration de la lumière en la recouvrant d’une boîte en caoutchouc ou en plastique de couleur unie et en la laissant intacte pendant 48 heures ou le point de temps souhaité pour l’imagerie. Préparez la tache en mélangeant de l’acide acétique 45% fraîchement dilué et du bleu de trypan à 0,1%.
Aliquote d’un millilitre de la solution de colorant dans des tubes à microcentrifugation. À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement la gaine de feuilles loin du ruban. À l’aide de pinces, placez la gaine dans le tube de microcentrifugation et assurez-vous qu’elle est complètement immergée dans la solution de colorant.
Laissez les tubes reposer pendant deux heures dans un bloc de chaleur de 40 degrés Celsius ou un bain-marie pour que le colorant pénètre dans la feuille. Ensuite, rincez soigneusement les gaines de feuilles trois fois dans 60% de glycérol frais pour enlever le colorant supplémentaire. Gardez la gaine dans du glycérol jusqu’à ce qu’elle soit prête à monter sur des lames.
Placez la gaine sur une lame de verre propre et ajoutez quelques gouttes de glycérol à 60%. À l’aide d’un microscope à dissection et de deux paires de pinces, déroulez soigneusement la gaine en laissant le centre inoculé orienté vers le haut. En tenant la gaine ouverte avec la pince, placez le couvercle sur le dessus pour empêcher la gaine de s’enrouler et de bloquer le site d’infection.
Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles pour un stockage à long terme ou d’un ruban adhésif à court terme. Observez les lames sous un microscope à lumière composée. Prenez des images de base avec un smartphone en montant un adaptateur de téléphone portable au microscope.
Pour les appareils Android, réglez les paramètres de l’application de l’appareil photo pour qu’ils clignotent, désactivez la prise de vue supérieure, désactivez le réglage automatique de la luminosité et des ombres et définissez la résolution de la photo sur complète. Après avoir monté le téléphone portable, prenez une image d’un micromètre à l’échelle avec un objectif souhaité pour l’acquisition des données. Ajustez le zoom du téléphone à 2,5 x et maintenez-le cohérent pour maintenir une taille de pixel cohérente.
Le centre de la gaine abrite la plus grande concentration de spores et d’appressoires infectantes. Par conséquent, visez neuf à 12 images de chaque gaine pour obtenir des nombres significatifs pour l’analyse statistique. Les sites d’infection de la gaine ont été imagés à l’aide d’un smartphone et d’un adaptateur de microscope pour smartphone après coloration au bleu trypan.
La chaleur et l’acide acétique dans la procédure de coloration adoucissent doucement le tissu foliaire. Les rinçages post-coloration à 60% de glycérol éliminent non seulement l’excès de tache, mais aident à réduire la diffusion de la lumière causée par la feuille et à améliorer la qualité de l’image. Les écarts par rapport au protocole de coloration peuvent entraîner des résultats sous-optimaux, comme illustré ici.
L’orge infectée par le type sauvage 4091 a produit des cellules infectées avec succès identifiées par la présence d’hyphes infectés à l’intérieur du tissu de la gaine foliaire. Dans le cas de l’infection mutante J99A, le développement réussi d’appressories et de piquets de pénétration a été remarqué, mais n’a pas produit d’hyphes invasifs. Le timing est important pour les tests basés sur les infections.
Des plantes et des spores fongiques bien vieillies sont essentielles au succès. Dans cette étude, nous avons examiné la présence ou l’absence des structures infectieuses. Des expériences supplémentaires pourraient répondre à des questions concernant le phénotype de la structure de l’infection et celui des hyphes envahisseurs.
Notre méthodologie n’est pas nouvelle, mais une version simplifiée et accessible d’une expérience plus complexe et plus coûteuse.
