هذا هو البروتوكول الأول الذي يسمح بتمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى خلايا بطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ ذات خصائص حاجز جيدة ، وتقاطعات ضيقة ناضجة ، وتعبير عن جزيئات التصاق الخلايا البطانية التي تتوسط هجرة الخلايا المناعية إلى نظام المبتدئ المركزي. تسمح الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC بدراسة هجرة الخلايا المناعية عبر حاجز الدم في الدماغ باستخدام نماذج حاجز الدم في الدماغ المستمدة من المرضى بطريقة ذاتية بالكامل. إن التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان من مرضى التصلب المتعدد إلى خلايا شبيهة ب EECM-BMEC قد سمح لنا بتحديد عيوب الحاجز الجوهري في هذه النماذج المختبرية لمرضى التصلب العصبي المتعدد.
وبالتالي ، ستسمح لنا هذه الطريقة الثقافية بتحديد المسارات الجزيئية الكامنة وراء خصائص الحاجز الضعيفة هذه في المستقبل. يمكن تطبيق هذه الطرق على مجموعة واسعة من الأمراض حيث يكون مورفولوجيا المصل وتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي أمرا بالغ الأهمية لهذه التسبب ، على سبيل المثال ، السكتة الدماغية أو العدوى العصبية. عند تجربة هذه التقنية لأول مرة ، استخدم نفس الكمية من مواد الخلية.
كثافة البذر هي مفتاح نجاح هذا البروتوكول وتحتاج إلى تعديل اعتمادا على الحيوانات المستنسخة المستخدمة. سيوضح الإجراء كينيا ماتسو ، أستاذ مساعد من مختبري. في اليوم الخامس من زراعة الخلايا السلفية البطانية ، نضح الوسط من الآبار وأضف ملليلترا واحدا من كاشف التفكك إلى كل بئر.
احتضان اللوحة لمدة ست إلى ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية. باستخدام micropipette فصل وتفرد الخلايا. بعد ذلك ، مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للترشيح في أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط DMEM / F-12 10.
لإيقاف تفاعل الهضم ، أضف DM DMEM / F-12 10 medium حتى علامة 50 ملليلتر. ماصة بدقة وحجز 10 ميكرولتر لحساب الخلايا. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 ملليلتر عند 200 غرام لمدة خمس دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية لحبيبات الخلايا.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية ب 10 ملليلتر من وسيط DMEM / F-12 10. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية لتكوير الخلايا مرة أخرى.
ثم أعد تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت للتدفق واحد. بعد ذلك ، أضف كاشف حجب FCR بنسبة واحد إلى 100 واحتضانه لمدة خمس دقائق. ثم أضف نسبة واحد إلى 200 من الفلوريسئين المخفف إيزوثيوسيانات أو الجسم المضاد CD31 المسمى FITC.
احتضان التعليق لمدة 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة تتراوح بين 20 و 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف 10 ملليلتر من مخزن التدفق المؤقت إلى العينة واحتفظ ب 10 ميكرولتر من المعلق لتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد جزء الخلايا الإيجابية CD31. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 غرام لمدة خمس دقائق في 20 إلى 25 درجة مئوية.
بعد الطرد المركزي إعادة تعليق الخلايا مع تدفق العازلة حل واحد. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من كوكتيل اختيار FITC لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. امزج المحلول جيدا عن طريق السحب واحتضانه في الظلام لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين 20 و 25 درجة مئوية.
بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من معلق الخلية. ماصة الخليط جيدا واحتضانه في الظلام لمدة 10 دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية. انقل معلق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة خمسة ملليلتر وأضف محلول التدفق واحدا للحصول على حجم إجمالي قدره 2.5 ملليلتر.
ثم ضع أنبوب قياس التدفق الخلوي في المغناطيس لمدة خمس دقائق. في حركة مستمرة ، اقلب المغناطيس وصب تعليق الخلية الذي يحتوي على خلايا الجسم المضاد FITC CD31 غير المصنفة. حافظ على المغناطيس والأنبوب في الوضع المقلوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان ثم قم بإزالة السائل المتبقي.
قم بشفط أي قطرات على حافة الأنبوب قبل إعادة الأنبوب إلى الوضع الرأسي. استرجع أنبوب قياس التدفق الخلوي من المغناطيس وأضف 2.5 ملليلتر من محلول التدفق لغسل الخلايا الموجبة CD31 المتبقية. ماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا مرتين أو ثلاث مرات لإعادة تعليقها.
ثم ضع أنبوب التدفق في المغناطيس لمدة خمس دقائق. كرر الغسيل أربع مرات على الأقل لإزالة الخلايا غير المصنفة FITC CD31 من الأنبوب. قم بإزالة أنبوب التدفق من المغناطيس وأعد تعليق الخلايا الموجبة CD31 المنقاة بالكمية المطلوبة من الوسط المناسب.
احتفظ بقنصتين سعة 10 ميكرولتر من التعليق ، واحدة لعد الخلايا والثانية لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم نقاء الخلايا الإيجابية CD31 في عينات فرز الخلايا المنشطة بعد المغناطيسية. قم بإزالة وسط HECSR من ألواح الآبار الست التي تحتوي على مجموعات الخلايا البطانية وغير البطانية. ثم أضف ملليلتر واحد من كاشف التفكك إلى كل بئر.
مراقبة بعناية مورفولوجيا الخلية تحت المجهر. عندما تبدو الخلايا البطانية ساطعة ومستديرة ، عادة في غضون دقيقتين إلى خمس دقائق ، افصلها عن طريق النقر على حافة اللوحة. تظل الخلايا غير البطانية متصلة باللوحة.
باستخدام ماصة صغيرة ، اجمع بعناية الخلايا البطانية المنفصلة دون إزعاج الخلايا غير البطانية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر أو 50 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من DMEM / F-12 10 لكل ملليلتر من كاشف التفكك. ثم أضف ملليلتر من وسط HECSR إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا غير البطانية المرفقة المتبقية لإنشاء العضلات الملساء مثل الخلايا أو SMLCs ووضع اللوحة في الحاضنة. نقل تعليق الخلية البطانية إلى أنبوب الطرد المركزي.
تخلط جيدا وحجز 10 ميكرولتر من التعليق لعد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتبقية في 200 غرام لمدة خمس دقائق في 20 إلى 25 درجة مئوية. ثم أضف ملليلتر من وسيط HECSR.
بعد ذلك ، قم بإزالة الكولاجين للمحلول من صفيحة الكولاجين المشفرة مسبقا بستة أطباق وأضف ملليلتر من تعليق الخلايا البطانية إلى كل بئر. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي لجزيئات وصلة الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC بما في ذلك claudin-5 و occludin و VE-cadherin لتقييم مورفولوجيا الخلية ووجود تقاطعات مستمرة وناضجة.
أدى تحفيز الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المصنفة على شرائح الغرفة مع السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا وإنترفيرون جاما المخفف في وسط مكيف مشتق من SMLC إلى تنظيم التعبير عن جزيئات الالتصاق مثل ICAM-1 و VCAM-1. صور تمثيلية لعلامات الخلايا العضلية الملساء، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء ألفا، والكالبونين، وبروتين العضلات الملساء 22 ألفا موضحة هنا. أدى تحفيز الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC باستخدام السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا وإنترفيرون جاما إلى تنظيم تعبير سطح الخلية للعديد من جزيئات الالتصاق بما في ذلك ICAM-1 و VCAM-1 و P-selectin.
علاوة على ذلك ، فإن التحفيز باستخدام السيتوكينات الالتهابية قد أدى أيضا إلى تنظيم التعبير عن جزيئات الالتصاق البطانية وتعزيز العدد المتزايد من الخلايا المناعية التي التصقت بالخلايا أحادية الطبقات الشبيهة ب EECM-BMEC الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC واعدة أيضا لفهم متعمق للآليات الفيزيولوجية المرضية على مستوى الحاجز الدموي الدماغي ، وكأداة قيمة لتطوير هدف علاجي جديد لتثبيت الحاجز الدموي الدماغي.
