Это первый протокол, позволяющий дифференцировать индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки в микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга с хорошими барьерными свойствами, зрелыми плотными соединениями и экспрессией молекул адгезии эндотелиальных клеток, опосредующих миграцию иммунных клеток в центральную систему новичков. EECM-BMEC-подобные клетки позволяют изучать миграцию иммунных клеток через гематоэнцефалический барьер с моделями гематоэнцефалического барьера, полученными от пациентов полностью аутологичным образом. Дифференциация индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток пациентов с РС в EECM-BMEC-подобные клетки позволила нам идентифицировать внутренние барьерные дефекты в этих моделях in vitro пациентов с РС.
Таким образом, этот культуральный метод позволит нам идентифицировать молекулярные пути, лежащие в основе этих нарушенных барьерных свойств в будущем. Эти методы могут быть применены к более широкому спектру заболеваний, где морфология сыворотки крови и инфильтрация иммунных клеток в ЦНС имеют решающее значение для этого патогенеза, например, инсульт или нейроинфекция. Пробуя эту технику впервые, используйте такое же количество клеточных материалов.
Плотность посева является ключом к успеху этого протокола и должна корректироваться в зависимости от используемых клонов. Продемонстрирует процедуру Кинья Мацуо, доцент моей лаборатории. На пятый день культивирования эндотелиальных клеток-предшественников аспирируют среду из лунок и добавляют в каждую лунку по одному миллилитру диссоциативного реагента.
Инкубируйте тарелку в течение шести-восьми минут при температуре 37 градусов по Цельсию. С помощью микропипетки диссоциируют и выделяют клетки. Затем пропустите клеточную суспензию через 40-микрометровый сетчатый фильтр для фильтрации в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров среды DMEM/F-12 10.
Чтобы остановить реакцию пищеварения, добавьте среду DM DMEM/F-12 10 до отметки 50 миллилитров. Тщательно проведите пипеткой и оставьте 10 микролитров для подсчета клеток. Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку весом 200 г в течение пяти минут при температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию, чтобы гранулировать ячейки.
После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу ячейки 10 миллилитрами среды DMEM/F-12 10. Перелейте клеточную суспензию в свежую 15-миллилитровую пробирку. Центрифуга при 200 г в течение пяти минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия, чтобы снова гранулировать клетки.
Затем ресуспендируйте гранулу ячейки в буфер потока. Затем добавьте реагент, блокирующий FCR, в соотношении один к 100 и выдерживайте в течение пяти минут. Затем добавьте разбавленный изотиоцианат флуоресцеина в соотношении один к 200 или меченое FITC антитело CD31.
Выдерживают суспензию 30 минут в темноте при температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию. В конце инкубации добавьте 10 миллилитров проточного буфера один к образцу и оставьте 10 микролитров суспензии для анализа проточной цитометрии для определения фракции CD31-положительных клеток. Центрифугируйте клетки при 200 г в течение пяти минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия.
После центрифугирования ресуспендируют клетки с проточным буфером одного раствора. Далее добавьте пять микролитров селекционного коктейля FITC на 100 микролитров клеточной суспензии. Тщательно перемешайте раствор пипеткой и инкубируйте в темноте в течение 15 минут при температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию.
Далее добавляют пять микролитров магнитных наночастиц на 100 микролитров клеточной суспензии. Хорошо нанесите смесь пипеткой и выдержите в темноте 10 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Перенесите клеточную суспензию в пятимиллилитровую проточную цитометрическую пробирку и добавьте проточный буфер один, чтобы получить общий объем 2,5 миллилитра.
Затем поместите проточную цитометрическую пробирку в магнит на пять минут. Непрерывным движением инвертируйте магнит и сцедите клеточную суспензию, содержащую немеченые клетки антитела FITC CD31. Держите магнит и трубку в перевернутом положении в течение двух-трех секунд, а затем удалите оставшуюся жидкость.
Аспирируйте все капли на краю трубки, прежде чем вернуть трубку в вертикальное положение. Извлеките проточную цитометрическую трубку из магнита и добавьте 2,5 миллилитра буфера потока, чтобы промыть оставшиеся CD31-положительные клетки. Аккуратно проведите пипеткой клетки вверх и вниз два или три раза, чтобы ресуспендировать их.
Затем поместите проточную трубку в магнит на пять минут. Повторите промывку не менее четырех раз, чтобы удалить немеченые клетки FITC CD31 из пробирки. Снимите проточную трубку с магнита и ресуспендируйте очищенные CD31-положительные клетки желаемым количеством подходящей среды.
Зарезервируйте две аликвоты суспензии по 10 микролитров, одну для подсчета клеток, а вторую для проведения проточного цитометрического анализа для оценки чистоты CD31-положительных клеток в образцах постмагнитной активированной сортировки клеток. Удалите среду HECSR из шести луночных пластин, содержащих популяции эндотелиальных и неэндотелиальных клеток. Затем добавьте в каждую лунку по одному миллилитру диссоциативного реагента.
Внимательно наблюдайте за морфологией клеток под микроскопом. Когда эндотелиальные клетки кажутся яркими и круглыми, обычно в течение двух-пяти минут, отделяют их, постукивая по краю пластины. Неэндотелиальные клетки остаются прикрепленными к пластине.
С помощью микропипетки осторожно соберите отделившиеся эндотелиальные клетки, не нарушая неэндотелиальные клетки, и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров или 50 миллилитров, содержащую четыре миллилитра DMEM/F-12 10 на миллилитр диссоциативного реагента. Затем добавьте два миллилитра среды HECSR в лунки, содержащие оставшиеся прикрепленные неэндотелиальные клетки, чтобы создать гладкомышечные клетки или SMLC, и поместите пластину в инкубатор. Перенесите суспензию эндотелиальных клеток в центрифужную пробирку.
Тщательно перемешайте и оставьте 10 микролитров суспензии для подсчета клеток. Центрифугируйте оставшиеся клетки при 200 г в течение пяти минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Затем добавьте два миллилитра среды HECCR.
Затем удалите коллаген для раствора из предварительно подготовленной шестилуночной пластины с кодировкой коллагена и добавьте два миллилитра суспензии эндотелиальных клеток в каждую лунку. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию в 5% углекислого газа. Иммунофлуоресцентное окрашивание молекул клеточных соединений EECM-BMEC, включая клаудин-5, окклюдин и VE-кадгерин, использовалось для оценки морфологии клеток и наличия непрерывных и зрелых соединений.
Стимуляция EECM-BMEC-подобных клеток, посеянных на предметных стеклах камеры, провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли альфа и гамма-интерферон, разбавленная в кондиционированной среде, полученной из SMLC, повышала экспрессию молекул адгезии, таких как ICAM-1 и VCAM-1. Здесь показаны репрезентативные изображения маркеров гладкомышечных клеток, включая альфа-актин гладких мышц, кальпонин и белок гладких мышц 22 альфа. Стимуляция EECM-BMEC-подобных клеток провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли альфа и гамма-интерферон, повышала экспрессию на клеточной поверхности нескольких молекул адгезии, включая ICAM-1, VCAM-1 и P-селектин.
Кроме того, стимуляция воспалительными цитокинами также повышала экспрессию молекул эндотелиальной адгезии и способствовала увеличению числа иммунных клеток, которые прилипали к монослоям EECM-BMEC-подобных клеток. EECM-BMEC-подобные клетки также являются перспективными для глубокого понимания патофизиологических механизмов на уровне гематоэнцефалического барьера и в качестве ценного инструмента для разработки новой терапевтической мишени для стабилизации гематоэнцефалического барьера.
