Il s’agit du premier protocole permettant de différencier les cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales ayant de bonnes propriétés barrières, des jonctions serrées matures et l’expression de molécules d’adhésion cellulaire endothéliale médiant la migration des cellules immunitaires dans le système novice central. Les cellules de type EECM-BMEC permettent d’étudier la migration des cellules immunitaires à travers la barrière hémato-encéphalique avec des modèles de barrière hémato-encéphalique dérivés des patients de manière entièrement autologue. La différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme provenant de patients atteints de SEP en cellules de type EECM-BMEC nous a permis d’identifier les défauts de barrière intrinsèque dans ces modèles in vitro des patients atteints de SEP.
Cette méthode culturale nous permettra donc d’identifier à l’avenir les voies moléculaires sous-jacentes à ces propriétés de barrière altérées. Ces méthodes peuvent être appliquées à un spectre plus large de maladies où, dans le sérum, la morphologie et l’infiltration des cellules immunitaires dans le SNC sont essentielles pour ces pathogenèses, par exemple, les accidents vasculaires cérébraux ou la neuroinfection. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, utilisez la même quantité de matériaux cellulaires.
La densité de semis est la clé du succès de ce protocole et doit être ajustée en fonction des clones utilisés. Kinya Matsuo, professeur adjoint de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Le cinquième jour de la culture de la cellule progénitrice endothéliale, aspirez le milieu des puits et ajoutez un millilitre de réactif de dissociation à chaque puits.
Incuber l’assiette pendant six à huit minutes à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, dissocier et singulariser les cellules. Ensuite, passez la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 40 micromètres pour filtrer dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM / F-12 10 milieu.
Pour arrêter la réaction de digestion, ajoutez DM DMEM / F-12 10 milieu jusqu’à la marque de 50 millilitres. Bien pipeter et réserver 10 microlitres pour compter les cellules. Centrifuger le tube de 50 millilitres à 200 g pendant cinq minutes à 20 à 25 degrés Celsius pour granuler les cellules.
Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec 10 millilitres de milieu DMEM/F-12 10. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 15 millilitres. Centrifuger à 200 g pendant cinq minutes à 20 à 25 degrés Celsius pour enrober à nouveau les cellules.
Ensuite, remettez en suspension la pastille de la cellule dans le tampon d’écoulement un. Ensuite, ajoutez le réactif bloquant le FCR dans un rapport de un à 100 et incuber pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite l’isothiocyanate de fluorescéine dilué d’un rapport d’un à 200 ou l’anticorps CD31 marqué FITC.
Incuber la suspension pendant 30 minutes dans l’obscurité à une température comprise entre 20 et 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 10 millilitres de tampon de flux un à l’échantillon et réserver 10 microlitres de suspension pour l’analyse par cytométrie en flux afin de déterminer la fraction de cellules CD31 positives. Centrifuger les cellules à 200 g pendant cinq minutes à 20 à 25 degrés Celsius.
Après centrifugation, remettre les cellules en suspension avec un tampon de débit une solution. Ensuite, ajoutez cinq microlitres du cocktail de sélection FITC par 100 microlitres de suspension cellulaire. Bien mélanger la solution par pipetage et incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes à une température comprise entre 20 et 25 degrés Celsius.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres de nanoparticules magnétiques par 100 microlitres de suspension cellulaire. Bien pipeter le mélange et incuber dans l’obscurité pendant 10 minutes à 20 à 25 degrés Celsius. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie en flux de cinq millilitres et ajoutez un tampon de flux pour obtenir un volume total de 2,5 millilitres.
Ensuite, placez le tube de cytométrie en flux dans l’aimant pendant cinq minutes. Dans un mouvement continu, inverser l’aimant et décanter la suspension cellulaire contenant des cellules non marquées d’anticorps FITC CD31. Maintenez l’aimant et le tube en position inversée pendant deux à trois secondes, puis retirez le liquide restant.
Aspirez les gouttelettes sur le bord du tube avant de remettre le tube en position verticale. Récupérez le tube de cytométrie en flux de l’aimant et ajoutez 2,5 millilitres de tampon de flux un pour laver les cellules CD31 positives restantes. Pipeter doucement les cellules de haut en bas deux ou trois fois pour les remettre en suspension.
Ensuite, placez le tube d’écoulement dans l’aimant pendant cinq minutes. Répétez le lavage au moins quatre fois pour retirer les cellules FITC CD31 non marquées du tube. Retirez le tube d’écoulement de l’aimant et remettez en suspension les cellules CD31 positives purifiées avec la quantité désirée d’un milieu approprié.
Réserver deux aliquotes de 10 microlitres de la suspension, l’une pour le comptage cellulaire et la seconde pour effectuer une analyse de cytométrie en flux afin d’évaluer la pureté des cellules CD31 positives dans des échantillons de tri de cellules activées post-magnétiques. Retirer le milieu HECSR des six plaques de puits contenant des populations de cellules endothéliales et non endothéliales. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de dissociation à chaque puits.
Observez attentivement la morphologie cellulaire au microscope. Lorsque les cellules endothéliales apparaissent brillantes et rondes, généralement dans les deux à cinq minutes, détachez-les en tapotant le bord de la plaque. Les cellules non endothéliales restent attachées à la plaque.
À l’aide d’une micropipette, prélever soigneusement les cellules endothéliales détachées sans déranger les cellules non endothéliales et les transférer dans un tube centrifuge de 15 millilitres ou 50 millilitres contenant quatre millilitres de DMEM / F-12 10 par millilitre de réactif de dissociation. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu HECSR dans les puits contenant les cellules non endothéliales restantes attachées pour établir le muscle lisse comme les cellules ou SMLC et placez la plaque dans l’incubateur. Transférer la suspension de cellules endothéliales dans un tube à centrifuger.
Bien mélanger et réserver 10 microlitres de la suspension pour le comptage cellulaire. Centrifuger les cellules restantes à 200 g pendant cinq minutes à 20 à 25 degrés Celsius. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu HECSR.
Ensuite, retirez le collagène pour solution d’une plaque de collagène codée à six puits préalablement préparée et ajoutez deux millilitres de la suspension de cellules endothéliales à chaque puits. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%. La coloration immunofluorescente de molécules jonctionnelles cellulaires de type EECM-BMEC, notamment la claudine-5, l’occludine et la VE-cadhérine, a été utilisée pour évaluer la morphologie cellulaire et la présence de jonctions continues et matures.
Stimulation des cellules de type EECM-BMEC ensemencées sur des lames de chambre avec des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha et l’interféron gamma dilués dans un milieu conditionné dérivé de SMLC régulé à la hausse l’expression de molécules d’adhésion telles que ICAM-1 et VCAM-1. Des images représentatives des marqueurs des cellules musculaires lisses, y compris l’actine du muscle lisse alpha, la calponine et la protéine du muscle lisse 22 alpha, sont présentées ici. La stimulation des cellules de type EECM-BMEC avec des cytokines pro-inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale alpha et l’interféron gamma a régulé à la hausse l’expression de surface cellulaire de plusieurs molécules d’adhésion, notamment ICAM-1, VCAM-1 et P-séclectine.
En outre, la stimulation avec des cytokines inflammatoires a également régulé à la hausse l’expression des molécules d’adhésion endothéliale et favorisé le nombre accru de cellules immunitaires qui ont adhéré aux monocouches cellulaires de type EECM-BMEC Les cellules de type EECM-BMEC sont également prometteuses pour une compréhension approfondie des mécanismes physiopathologiques au niveau de la barrière hémato-encéphalique et comme outil précieux pour développer une nouvelle cible thérapeutique pour la stabilisation de la barrière hémato-encéphalique.
