Este é o primeiro protocolo que permite diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células endoteliais microvasculares cerebrais com boas propriedades de barreira, tight junctions maduras e expressão de moléculas de adesão de células endoteliais mediando a migração de células imunes para o sistema central novato. As células EECM-BMEC-like permitem estudar a migração de células imunes através da barreira hematoencefálica com modelos de barreira hematoencefálica derivados dos pacientes de forma totalmente autóloga. A diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de pacientes com EM em células EECM-BMEC-like nos permitiu identificar defeitos de barreira intrínsecos nesses modelos in vitro de pacientes com EM.
Este método cultural permitirá, portanto, identificar as vias moleculares subjacentes a essas propriedades de barreira prejudicadas no futuro. Esses métodos podem ser aplicados a um espectro mais amplo de doenças, onde a morfologia sérica e a infiltração de células imunes no SNC são críticas para essas patogêneses, por exemplo, acidente vascular cerebral ou neuroinfecção. Ao tentar esta técnica pela primeira vez, use a mesma quantidade de materiais celulares.
A densidade de semeadura é a chave para o sucesso deste protocolo e precisa ser ajustada dependendo dos clones utilizados. Quem demonstrará o procedimento será Kinya Matsuo, professora assistente do meu laboratório. No quinto dia da cultura das células progenitoras endoteliais, aspirar o meio dos poços e adicionar um mililitro de reagente de dissociação a cada poço.
Incubar a placa por seis a oito minutos a 37 graus Celsius. Usando uma micropipeta dissociar e singularizar as células. Em seguida, passe a suspensão celular através de um filtro de células de 40 micrômetros para filtrar em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio DMEM/F-12 10.
Para interromper a reação de digestão, adicione o meio DMEM/F-12 10 até a marca de 50 mililitros. Pipetar bem e reservar 10 microlitros para contagem das células. Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 200 g por cinco minutos a 20 a 25 graus Celsius para pellet as células.
Após a centrifugação, retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 10 mililitros de meio DMEM/F-12 10. Transfira a suspensão celular para um novo tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 graus Celsius para peletizar novamente as células.
Em seguida, ressuspenda a pastilha da célula no tampão de fluxo um. Em seguida, adicione o reagente de bloqueio do FCR na proporção de um para 100 e incube por cinco minutos. Em seguida, adicione o isotiocianato de fluoresceína diluído na proporção de um para 200 ou o anticorpo CD31 marcado com FITC.
Incubar a suspensão durante 30 minutos no escuro a uma temperatura entre 20 e 25 graus Celsius. Ao final da incubação, adicionar 10 mililitros de tampão de fluxo um à amostra e reservar 10 microlitros da suspensão para análise por citometria de fluxo para determinação da fração de células CD31 positivas. Centrifugar as células a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 graus Celsius.
Após a centrifugação, ressuspenda as células com uma solução tampão de fluxo. Em seguida, adicione cinco microlitros do coquetel de seleção FITC por 100 microlitros da suspensão celular. Misture bem a solução por pipetagem e incube no escuro durante 15 minutos a uma temperatura entre 20 e 25 graus Celsius.
Em seguida, adicione cinco microlitros de nanopartículas magnéticas por 100 microlitros de suspensão celular. Pipetar bem a mistura e incubar no escuro por 10 minutos a 20 a 25 graus Celsius. Transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo de cinco mililitros e adicione um tampão de fluxo para obter um volume total de 2,5 mililitros.
Em seguida, coloque o tubo de citometria de fluxo no ímã por cinco minutos. Em um movimento contínuo, inverta o ímã e decante a suspensão celular contendo células não marcadas com anticorpo FITC CD31. Mantenha o ímã e o tubo na posição invertida por dois a três segundos e, em seguida, remova o líquido restante.
Aspirar quaisquer gotículas na borda do tubo antes de retornar o tubo à posição vertical. Recupere o tubo de citometria de fluxo do ímã e adicione 2,5 mililitros de tampão de fluxo um para lavar as células CD31 positivas restantes. Pipetar suavemente as células para cima e para baixo duas ou três vezes para ressuspendê-las.
Em seguida, coloque o tubo de fluxo no ímã por cinco minutos. Repita a lavagem pelo menos quatro vezes para remover as células não marcadas FITC CD31 do tubo. Remova o tubo de fluxo do ímã e ressuspenda as células CD31 positivas purificadas com a quantidade desejada de um meio adequado.
Reserve duas alíquotas de 10 microlitros da suspensão, uma para contagem de células e a segunda para análise por citometria de fluxo para avaliar a pureza de células CD31 positivas em amostras de triagem de células pós-ativadas por magnetismo. Remover o meio HECSR das seis placas de poço contendo populações de células endoteliais e não endoteliais. Em seguida, adicione um mililitro de reagente de dissociação a cada poço.
Observe cuidadosamente a morfologia celular ao microscópio. Quando as células endoteliais aparecerem brilhantes e redondas, geralmente dentro de dois a cinco minutos, desconecte-as batendo na borda da placa. As células não endoteliais permanecem aderidas à placa.
Usando uma micropipeta, coletar cuidadosamente as células endoteliais destacadas sem perturbar as células não endoteliais e transferi-las para um tubo centrífugo de 15 mililitros ou 50 mililitros contendo quatro mililitros de DMEM/F-12 10 por mililitro de reagente de dissociação. Em seguida, adicione dois mililitros de meio HECSR aos poços contendo as células não endoteliais aderidas restantes para estabelecer as células semelhantes ao músculo liso ou SMLCs e coloque a placa na incubadora. Transfira a suspensão de células endoteliais para um tubo de centrífuga.
Misture bem e reserve 10 microlitros da suspensão para contagem de células. Centrifugar as células restantes a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros de meio HECSR.
Em seguida, remova o colágeno para solução de uma placa de colágeno codificada de seis poços previamente preparada e adicione dois mililitros da suspensão de células endoteliais a cada poço. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. A coloração imunofluorescente de moléculas juncionais celulares EECM-BMEC-like em incluindo claudina-5, ocludina e VE-caderina foi usada para avaliar a morfologia celular e a presença de junções contínuas e maduras.
A estimulação das células EECM-BMEC-like semeadas em lâminas de câmara com citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa e interferon gama diluído em meio condicionado derivado de SMLC aumentou a expressão de moléculas de adesão como ICAM-1 e VCAM-1. Imagens representativas de marcadores de células musculares lisas, incluindo alfa actina de músculo liso, calponina e proteína 22 alfa de músculo liso são mostradas aqui. A estimulação das células EECM-BMEC-like com citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa e interferon gama upregulated a expressão na superfície celular de várias moléculas de adesão, incluindo ICAM-1, VCAM-1 e P-selectina.
Além disso, a estimulação com citocinas inflamatórias também aumentou a expressão de moléculas de adesão endotelial e promoveu o aumento do número de células imunes que aderiram às monocamadas celulares EECM-BMEC-like As células EECM-BMEC-like são promissoras também para a compreensão profunda dos mecanismos fisiopatológicos no nível da barreira hematoencefálica e como uma ferramenta valiosa para desenvolver um novo alvo terapêutico para a estabilização da barreira hematoencefálica.
