Bu, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri, iyi bariyer özelliklerine, olgun sıkı kavşaklara ve merkezi acemi sisteme bağışıklık hücresi göçüne aracılık eden endotel hücre adezyon moleküllerinin ekspresyonuna sahip beyin mikrovasküler endotel hücrelerine ayırt etmeyi sağlayan ilk protokoldür. EECM-BMEC benzeri hücreler, hastalardan türetilen kan beyin bariyeri modelleri ile kan beyin bariyeri boyunca bağışıklık hücresi göçünü tamamen otolog bir şekilde incelemeye izin verir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin MS hastalarından EECM-BMEC benzeri hücrelere ayırt edilmesi, MS hastalarının bu in vitro modellerinde intrinsik bariyer defektlerini tanımlamamızı sağlamıştır.
Bu nedenle, bu kültürel yöntem, gelecekte bu bozulmuş bariyer özelliklerinin altında yatan moleküler yolları tanımlamamıza izin verecektir. Bu yöntemler, serum morfolojisinde ve immün hücre infiltrasyonunun bu patogenezde, örneğin inme veya nöroenfeksiyon için kritik olduğu daha geniş bir hastalık spektrumuna uygulanabilir. Bu tekniği ilk kez denerken, aynı miktarda hücre materyali kullanın.
Tohumlama yoğunluğu bu protokolün başarısının anahtarıdır ve kullanılan klonlara bağlı olarak ayarlanması gerekir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yardımcı doçent Kinya Matsuo olacak. Endotelyal progenitör hücrenin beşinci gününde, kültürü ortamdan aspire eder ve her bir kuyucuğa bir mililitre ayrışma reaktifi ekler.
Plakayı 37 santigrat derecede altı ila sekiz dakika boyunca inkübe edin. Bir mikropipet kullanarak hücreleri ayrıştırın ve tekilleştirin. Ardından, 10 mililitre DMEM / F-12 10 ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.
Sindirim reaksiyonunu durdurmak için, 50 mililitre işaretine kadar DM DMEM / F-12 10 ortamı ekleyin. İyice pipet yapın ve hücreleri saymak için 10 mikrolitre ayırın. Hücreleri pelet etmek için 50 mililitrelik tüpü 200 g'da beş dakika boyunca 20 ila 25 santigrat derecede santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre DMEM / F-12 10 ortamı ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu taze bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Hücreleri tekrar pelet etmek için 200 g'da beş dakika boyunca 20 ila 25 santigrat derecede santrifüjleyin.
Daha sonra hücre peletini akış tamponuna yeniden askıya alın. Ardından, FCR bloke edici reaktifi bir ila 100 oranında ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra bir ila 200 oranında seyreltilmiş floresein izotiyosiyanat veya FITC etiketli CD31 antikoru ekleyin.
Süspansiyonu karanlıkta 20 ila 25 santigrat derece arasındaki bir sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numuneye bir tane 10 mililitre akış tamponu ekleyin ve CD31 pozitif hücrelerin fraksiyonunu belirlemek için akış sitometri analizi için süspansiyonun 10 mikrolitresini ayırın. Hücreleri 200 g'da 20 ila 25 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, hücreleri akış tamponu ile bir çözelti ile yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresi başına beş mikrolitre FITC seçim kokteyli ekleyin. Çözeltiyi pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 20 ila 25 santigrat derece arasındaki bir sıcaklıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra, 100 mikrolitre hücre süspansiyonu başına beş mikrolitre manyetik nanopartikül ekleyin. Karışımı iyice pipetleyin ve karanlıkta 20 ila 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonunu beş mililitrelik bir akış sitometri tüpüne aktarın ve toplam 2,5 mililitrelik bir hacim elde etmek için bir akış tamponu ekleyin.
Daha sonra akış sitometri tüpünü mıknatısın içine beş dakika boyunca yerleştirin. Sürekli bir hareketle, mıknatısı ters çevirin ve FITC CD31 antikoru etiketsiz hücreler içeren hücre süspansiyonunu boşaltın. Mıknatısı ve tüpü ters çevrilmiş konumda iki ila üç saniye boyunca tutun ve ardından kalan sıvıyı çıkarın.
Tüpü dik konuma getirmeden önce tüp kenarındaki damlacıkları aspire edin. Akış sitometri tüpünü mıknatıstan alın ve kalan CD31 pozitif hücreleri yıkamak için 2.5 mililitre akış tamponu ekleyin. Hücreleri yeniden askıya almak için iki veya üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetin.
Ardından akış tüpünü beş dakika boyunca mıknatısın içine yerleştirin. FITC CD31 etiketsiz hücreleri tüpten çıkarmak için yıkamayı en az dört kez tekrarlayın. Akış tüpünü mıknatıstan çıkarın ve saflaştırılmış CD31 pozitif hücreleri istenen miktarda uygun bir ortamla yeniden askıya alın.
Biri hücre sayımı için, ikincisi ise manyetik sonrası aktive edilmiş hücre sıralama numunelerinde CD31 pozitif hücrelerin saflığını değerlendirmek için akış sitometri analizi yapmak için süspansiyonun iki adet 10 mikrolitrelik alikotunu ayırın. HECSR ortamını endotel ve endotel dışı hücre popülasyonlarını içeren altı kuyu plakasından çıkarın. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyin.
Hücre morfolojisini mikroskop altında dikkatlice gözlemleyin. Endotel hücreleri parlak ve yuvarlak göründüğünde, genellikle iki ila beş dakika içinde, plakanın kenarına dokunarak onları ayırın. Endotel dışı hücreler plakaya bağlı kalır.
Bir mikropipet kullanarak, endotel dışı hücreleri rahatsız etmeden ayrılmış endotel hücrelerini dikkatlice toplayın ve bunları mililitre ayrışma reaktifi başına dört mililitre DMEM / F-12 10 içeren 15 mililitre veya 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, düz kas benzeri hücreleri veya SMLC'leri oluşturmak ve plakayı inkübatöre yerleştirmek için kalan bağlı endotel dışı hücreleri içeren kuyucuklara iki mililitre HECSR ortamı ekleyin. Endotel hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın.
İyice karıştırın ve hücre sayımı için süspansiyonun 10 mikrolitresini ayırın. Kalan hücreleri 200 g'da beş dakika boyunca 20 ila 25 santigrat derecede santrifüj edin. Ardından iki mililitre HECSR ortamı ekleyin.
Daha sonra, çözelti için kolajeni önceden hazırlanmış altı kuyucuk plakası kodlu bir kollajenden çıkarın ve her bir kuyucuğa iki mililitre endotel hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, plakayı% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. EECM-BMEC benzeri hücre bileşke moleküllerinin claudin-5, oklüdin ve VE-kadherin dahil olmak üzere immünofloresan boyanması, hücre morfolojisini ve sürekli ve olgun kavşakların varlığını değerlendirmek için kullanıldı.
SMLC türevli şartlandırılmış ortamda seyreltilmiş tümör nekroz faktörü alfa ve interferon gama gibi pro-inflamatuar sitokinlerle oda slaytlarına tohumlanan EECM-BMEC benzeri hücrelerin uyarılması, ICAM-1 ve VCAM-1 gibi adezyon moleküllerinin ekspresyonunu yukarı regüle eder. Alfa düz kas aktin, kalponin ve düz kas proteini 22 alfa dahil olmak üzere düz kas hücresi belirteçlerinin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. EECM-BMEC benzeri hücrelerin tümör nekroz faktörü alfa ve interferon gama gibi pro-inflamatuar sitokinlerle uyarılması, ICAM-1, VCAM-1 ve P-selektin dahil olmak üzere çeşitli adezyon moleküllerinin hücre yüzey ekspresyonunu yukarı regüle eder.
Ayrıca, enflamatuar sitokinlerle stimülasyon, endotel adezyon moleküllerinin ekspresyonunu da arttırdı ve EECM-BMEC benzeri hücre monokatmanlarına yapışan artan sayıda bağışıklık hücresini teşvik etti EECM-BMEC benzeri hücreler, kan-beyin bariyeri seviyesindeki patofizyolojik mekanizmaların derinlemesine anlaşılması için umut vericidir ve kan-beyin bariyeri stabilizasyonu için yeni terapötik hedef geliştirmek için değerli bir araç olarak umut vericidir.
