Questo è il primo protocollo che consente di differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule endoteliali microvascolari cerebrali con buone proprietà barriera, giunzioni strette mature ed espressione di molecole di adesione delle cellule endoteliali che mediano la migrazione delle cellule immunitarie nel sistema centrale dei novizi. Le cellule simil-EECM-BMEC consentono di studiare la migrazione delle cellule immunitarie attraverso la barriera ematoencefalica con modelli di barriera ematoencefalica derivati dai pazienti in modo completamente autologo. La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dai pazienti con SM in cellule simili a EECM-BMEC ci ha permesso di identificare difetti di barriera intrinseca in questi modelli in vitro dei pazienti con SM.
Questo metodo culturale ci permetterà quindi di identificare i percorsi molecolari alla base di queste proprietà barriera alterate in futuro. Questi metodi possono essere applicati a uno spettro più ampio di malattie in cui la morfologia del siero e l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel SNC sono fondamentali per questa patogenesi, ad esempio ictus o neuroinfezione. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, utilizzare la stessa quantità di materiali cellulari.
La densità di semina è la chiave del successo di questo protocollo e deve essere regolata a seconda dei cloni utilizzati. A dimostrare la procedura sarà Kinya Matsuo, assistente professore del mio laboratorio. Il quinto giorno della coltura delle cellule progenitrici endoteliali aspirare il mezzo dai pozzetti e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra per sei-otto minuti a 37 gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta dissociare e singolarizzare le cellule. Quindi, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di terreno DMEM / F-12 10.
Per interrompere la reazione di digestione, aggiungere DM DMEM / F-12 10 medio fino al segno di 50 millilitri. Pipettare accuratamente e riservare 10 microlitri per il conteggio delle celle. Centrifugare il tubo da 50 millilitri a 200 g per cinque minuti a 20-25 gradi Celsius per pellettare le celle.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di DMEM/F-12 10 mezzo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo fresco da 15 millilitri. Centrifugare a 200 g per cinque minuti a 20-25 gradi Celsius per pellettare nuovamente le cellule.
Quindi risospendere il pellet di cella in un buffer di flusso. Quindi, aggiungere il reagente bloccante FCR con un rapporto di uno a 100 e incubare per cinque minuti. Quindi aggiungere l'isotiocianato di fluoresceina diluito da uno a 200 o l'anticorpo CD31 marcato FITC.
Incubare la sospensione per 30 minuti al buio a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di flusso uno al campione e riservare 10 microlitri della sospensione per l'analisi citometrica a flusso per determinare la frazione di cellule CD31 positive. Centrifugare le cellule a 200 g per cinque minuti a 20-25 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione risospendere le celle con tampone di flusso una soluzione. Quindi, aggiungere cinque microlitri del cocktail di selezione FITC per 100 microlitri della sospensione cellulare. Mescolare accuratamente la soluzione mediante pipettaggio e incubare al buio per 15 minuti a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius.
Quindi, aggiungere cinque microlitri di nanoparticelle magnetiche per 100 microlitri di sospensione cellulare. Pipettare bene la miscela e incubare al buio per 10 minuti a 20-25 gradi Celsius. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di citometria a flusso da cinque millilitri e aggiungere un buffer di flusso per ottenere un volume totale di 2,5 millilitri.
Quindi posizionare il tubo di citometria a flusso nel magnete per cinque minuti. In un movimento continuo, invertire il magnete e decantare la sospensione cellulare contenente cellule non marcate dell'anticorpo FITC CD31. Mantenere il magnete e il tubo in posizione invertita per due o tre secondi, quindi rimuovere il liquido rimanente.
Aspirare eventuali goccioline sul bordo del tubo prima di riportare il tubo in posizione verticale. Recuperare il tubo di citometria a flusso dal magnete e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di flusso per lavare le restanti cellule CD31 positive. Pipettare delicatamente le cellule su e giù due o tre volte per risospenderle.
Quindi posizionare il tubo di flusso nel magnete per cinque minuti. Ripetere il lavaggio almeno quattro volte per rimuovere le cellule non etichettate FITC CD31 dal tubo. Rimuovere il tubo di flusso dal magnete e risospendere le cellule CD31 positive purificate con la quantità desiderata di un mezzo adatto.
Riservare due aliquote da 10 microlitri della sospensione, una per il conteggio delle cellule e la seconda per effettuare analisi di citometria a flusso per valutare la purezza delle cellule CD31 positive nei campioni di selezione cellulare attivata post-magnetica. Rimuovere il mezzo HECSR dalle sei piastre del pozzetto contenenti popolazioni di cellule endoteliali e non endoteliali. Quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto.
Osservare attentamente la morfologia cellulare al microscopio. Quando le cellule endoteliali appaiono luminose e rotonde, di solito entro due o cinque minuti, staccarle toccando il bordo della piastra. Le cellule non endoteliali rimangono attaccate alla piastra.
Utilizzando una micropipetta, raccogliere con cura le cellule endoteliali distaccate senza disturbare le cellule non endoteliali e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 millilitri o 50 millilitri contenente quattro millilitri di DMEM / F-12 10 per millilitro di reagente di dissociazione. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo HECSR ai pozzetti contenenti le restanti cellule non endoteliali attaccate per stabilire la muscolatura liscia come cellule o SMLC e posizionare la piastra nell'incubatore. Trasferire la sospensione di cellule endoteliali in una provetta da centrifuga.
Mescolare accuratamente e riservare 10 microlitri della sospensione per il conteggio delle cellule. Centrifugare le cellule rimanenti a 200 g per cinque minuti a 20-25 gradi Celsius. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo HECSR.
Quindi, rimuovere il collagene per la soluzione da una piastra di collagene codificata a sei pozzetti precedentemente preparata e aggiungere due millilitri della sospensione di cellule endoteliali a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. La colorazione immunofluorescente di molecole giunzionali cellulari simili a EECM-BMEC in cui claudina-5, occludina e VE-caderina è stata utilizzata per valutare la morfologia cellulare e la presenza di giunzioni continue e mature.
La stimolazione delle cellule simil-settec seminate su vetrini da camera con citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa e l'interferone gamma diluito in mezzo condizionato derivato da SMLC ha sovraregolato l'espressione di molecole di adesione come ICAM-1 e VCAM-1. Qui sono mostrate immagini rappresentative dei marcatori delle cellule muscolari lisce, tra cui l'actina della muscolatura liscia alfa, la calponina e la proteina 22 alfa della muscolatura liscia. La stimolazione delle cellule simil-EECM-BMEC con citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa e l'interferone gamma ha sovraregolato l'espressione della superficie cellulare di diverse molecole di adesione tra cui ICAM-1, VCAM-1 e P-selectina.
Inoltre, la stimolazione con citochine infiammatorie ha anche sovraregolato l'espressione delle molecole di adesione endoteliale e ha promosso l'aumento del numero di cellule immunitarie che hanno aderito ai monostrati cellulari simili a EECM-BMEC Le cellule simil-BMEC sono promettenti anche per una comprensione approfondita dei meccanismi fisiopatologici a livello della barriera emato-encefalica e come strumento prezioso per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per la stabilizzazione della barriera emato-encefalica.
