Este es el primer protocolo que permite diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos en células endoteliales microvasculares cerebrales con buenas propiedades de barrera, uniones estrechas maduras y expresión de moléculas de adhesión de células endoteliales que median la migración de células inmunes hacia el sistema central novato. Las células tipo EECM-BMEC permiten estudiar la migración de células inmunes a través de la barrera hematoencefálica con modelos de barrera hematoencefálica derivados de los pacientes de una manera totalmente autóloga. La diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas por humanos de los pacientes con EM en células similares a EECM-BMEC nos ha permitido identificar defectos de barrera intrínsecos en estos modelos in vitro de los pacientes con EM.
Por lo tanto, este método cultural nos permitirá identificar las vías moleculares subyacentes a estas propiedades de barrera deterioradas en el futuro. Estos métodos se pueden aplicar a un espectro más amplio de enfermedades donde la morfología sérica y la infiltración de células inmunes en el SNC son críticas para esta patogénesis, por ejemplo, accidente cerebrovascular o neuroinfección. Cuando pruebe esta técnica por primera vez, use la misma cantidad de materiales celulares.
La densidad de siembra es la clave del éxito de este protocolo y debe ajustarse en función de los clones utilizados. Demostrando el procedimiento estará Kinya Matsuo, profesora asistente de mi laboratorio. En el quinto día del cultivo de células progenitoras endoteliales, aspirar el medio de los pocillos y agregar un mililitro de reactivo de disociación a cada pocillo.
Incubar el plato durante seis a ocho minutos a 37 grados centígrados. Mediante una micropipeta disociar y singularizar las células. Luego, pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros para filtrar en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de DMEM / F-12 10 medio.
Para detener la reacción de digestión, agregue DM DMEM / F-12 10 medio hasta la marca de 50 mililitros. Pipetear bien y reservar 10 microlitros para contar las células. Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 grados centígrados para granular las células.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de DMEM / F-12 10 medio. Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco de 15 mililitros. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 grados centígrados para granular las células de nuevo.
Luego resuspenda el pellet de la celda en el tampón de flujo uno. A continuación, agregue el reactivo de bloqueo FCR en una proporción de uno a 100 e incube durante cinco minutos. Luego agregue el isotiocianato de fluoresceína diluido de una a 200 o el anticuerpo CD31 marcado con FIFC.
Incubar la suspensión durante 30 minutos en la oscuridad a una temperatura entre 20 y 25 grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 10 mililitros de tampón de flujo uno a la muestra y reserve 10 microlitros de la suspensión para el análisis de citometría de flujo para determinar la fracción de células CD31 positivas. Centrifugar las células a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 grados centígrados.
Después de la centrifugación, resuspender las células con tampón de flujo una solución. A continuación, agregue cinco microlitros del cóctel de selección FITC por cada 100 microlitros de la suspensión celular. Mezclar bien la solución pipeteando e incubar en la oscuridad durante 15 minutos a una temperatura entre 20 y 25 grados centígrados.
A continuación, agregue cinco microlitros de nanopartículas magnéticas por cada 100 microlitros de suspensión celular. Pipetear bien la mezcla e incubar en la oscuridad durante 10 minutos a 20 a 25 grados centígrados. Transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo de cinco mililitros y agregue un tampón de flujo para obtener un volumen total de 2.5 mililitros.
Luego coloque el tubo de citometría de flujo en el imán durante cinco minutos. En un movimiento continuo, invertir el imán y decantar la suspensión celular que contiene células no marcadas con anticuerpos FITC CD31. Mantenga el imán y el tubo en la posición invertida durante dos o tres segundos y luego retire el líquido restante.
Aspire cualquier gota en el borde del tubo antes de devolver el tubo a una posición vertical. Recupere el tubo de citometría de flujo del imán y agregue 2,5 mililitros de tampón de flujo uno para lavar las células CD31 positivas restantes. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para resuspenderlas.
Luego coloque el tubo de flujo en el imán durante cinco minutos. Repita el lavado al menos cuatro veces para eliminar las células FITC CD31 no marcadas del tubo. Retire el tubo de flujo del imán y resuspenda las células CD31 positivas purificadas con la cantidad deseada de un medio adecuado.
Reservar dos alícuotas de 10 microlitros de la suspensión, una para el recuento celular y la segunda para realizar análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de células CD31 positivas en muestras de clasificación celular activada postmagnéticamente. Retire el medio HECSR de las seis placas de pocillos que contienen poblaciones de células endoteliales y no endoteliales. Luego agregue un mililitro de reactivo de disociación a cada pocillo.
Observe cuidadosamente la morfología celular bajo un microscopio. Cuando las células endoteliales aparecen brillantes y redondas, generalmente dentro de dos a cinco minutos, sepáralas golpeando el borde de la placa. Las células no endoteliales permanecen unidas a la placa.
Usando una micropipeta, recolecte cuidadosamente las células endoteliales desprendidas sin alterar las células no endoteliales y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 mililitros o 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de DMEM / F-12 10 por mililitro de reactivo de disociación. Luego agregue dos mililitros de medio HECSR a los pocillos que contienen las células no endoteliales unidas restantes para establecer las células similares al músculo liso o SMLC y coloque la placa en la incubadora. Transfiera la suspensión de células endoteliales a un tubo centrífugo.
Mezclar bien y reservar 10 microlitros de la suspensión para el conteo de células. Centrifugar las células restantes a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 grados centígrados. Luego agregue dos mililitros de medio HECSR.
A continuación, retire el colágeno para solución de una placa de colágeno codificada previamente de seis pocillos y agregue dos mililitros de la suspensión de células endoteliales a cada pocillo. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. La tinción inmunofluorescente de moléculas de unión celular similares a EECM-BMEC en incluyendo claudina-5, ocludina y VE-cadherina se utilizó para evaluar la morfología celular y la presencia de uniones continuas y maduras.
La estimulación de las células tipo EECM-BMEC sembradas en portaobjetos de cámara con citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón gamma diluido en medio condicionado derivado de SMLC reguló al alza la expresión de moléculas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1. Aquí se muestran imágenes representativas de marcadores de células musculares lisas, incluyendo actina alfa del músculo liso, calponina y proteína del músculo liso 22 alfa. La estimulación de las células similares a EECM-BMEC con citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón gamma reguló al alza la expresión de la superficie celular de varias moléculas de adhesión, incluidas ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina.
Además, la estimulación con citoquinas inflamatorias también reguló al alza la expresión de moléculas de adhesión endotelial y promovió el aumento del número de células inmunes que se adhirieron a monocapas celulares similares a EECM-BMEC Las células similares a EECM-BMEC también son prometedoras para una comprensión profunda de los mecanismos fisiopatológicos a nivel de la barrera hematoencefálica, y como una herramienta valiosa para desarrollar un nuevo objetivo terapéutico para la estabilización de la barrera hematoencefálica.
