Dies ist das erste Protokoll, das es ermöglicht, human-induzierte pluripotente Stammzellen in mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns mit guten Barriereeigenschaften, reifen Tight Junctions und der Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen zu differenzieren, die die Migration von Immunzellen in das zentrale Novizensystem vermitteln. EECM-BMEC-ähnliche Zellen ermöglichen es, die Migration von Immunzellen über die Blut-Hirn-Schranke mit Blut-Hirn-Schrankenmodellen zu untersuchen, die vollständig autologen von den Patienten abgeleitet wurden. Die Differenzierung von human-induzierten pluripotenten Stammzellen von MS-Patienten in EECM-BMEC-ähnliche Zellen hat es uns ermöglicht, intrinsische Barrieredefekte in diesen In-vitro-Modellen der MS-Patienten zu identifizieren.
Diese Kulturmethode wird es uns daher in Zukunft ermöglichen, die molekularen Signalwege zu identifizieren, die diesen gestörten Barriereeigenschaften zugrunde liegen. Diese Methoden können auf ein breiteres Spektrum von Erkrankungen angewendet werden, bei denen die Serummorphologie und die Infiltration von Immunzellen in das ZNS für diese Pathogenese entscheidend sind, z. B. Schlaganfall oder Neuroinfektion. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, verwenden Sie die gleiche Menge an Zellmaterialien.
Die Seeding-Dichte ist der Schlüssel zum Erfolg dieses Protokolls und muss je nach verwendetem Klon angepasst werden. Kinya Matsuo, Assistenzprofessorin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Am fünften Tag der Kultivierung der endothelialen Vorläuferzellen saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen ab und geben einen Milliliter Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung.
Die Platte sechs bis acht Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mit einer Mikropipette dissoziieren und singularisieren Sie die Zellen. Anschließend wird die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb geleitet, um sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern DMEM/F-12 10-Medium zu filtern.
Um die Verdauungsreaktion zu stoppen, wird DM DMEM/F-12 10 Medium bis zur 50-Milliliter-Marke zugegeben. Pipettieren Sie gründlich und reservieren Sie 10 Mikroliter für die Zählung der Zellen. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 200 g für fünf Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Zellpellet mit 10 Millilitern DMEM/F-12 10 Medium resuspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 200 g für fünf Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius, um die Zellen erneut zu pelletieren.
Anschließend wird das Zellpellet in den Flow-Puffer eins resuspendiert. Als nächstes fügen Sie das FCR-blockierende Reagenz in einem Verhältnis von eins zu 100 hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang. Fügen Sie dann den verdünnten Fluorescein-Isothiocyanat- oder FITC-markierten CD31-Antikörper im Verhältnis von einem zu 200 hinzu.
Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen 20 und 25 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation werden der Probe 10 Milliliter Flusspuffer eins zugegeben und 10 Mikroliter der Suspension für die durchflusszytometrische Analyse reserviert, um den Anteil der CD31-positiven Zellen zu bestimmen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g für fünf Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen mit einer Flow-Buffer-One-Lösung. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter des FITC-Auswahlcocktails pro 100 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung gründlich durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen 20 und 25 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter magnetische Nanopartikel pro 100 Mikroliter Zellsuspension hinzu. Die Mischung gut pipettieren und im Dunkeln 10 Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Durchflusszytometrieröhrchen und fügen Sie Durchflusspuffer eins hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2,5 Millilitern zu erhalten.
Legen Sie dann das Durchflusszytometrieröhrchen für fünf Minuten in den Magneten. Drehen Sie den Magneten in einer kontinuierlichen Bewegung um und dekantieren Sie die Zellsuspension, die nicht markierte FITC-CD31-Antikörperzellen enthält. Halten Sie den Magneten und den Schlauch zwei bis drei Sekunden lang in der umgekehrten Position und entfernen Sie dann die restliche Flüssigkeit.
Saugen Sie alle Tröpfchen am Rand des Röhrchens ab, bevor Sie das Röhrchen wieder in eine aufrechte Position bringen. Nehmen Sie das Durchflusszytometrieröhrchen aus dem Magneten und fügen Sie 2,5 Milliliter Durchflusspuffer eins hinzu, um die verbleibenden CD31-positiven Zellen zu waschen. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig zwei- oder dreimal auf und ab, um sie wieder zu suspendieren.
Setzen Sie dann das Strömungsrohr für fünf Minuten in den Magneten ein. Wiederholen Sie das Waschen mindestens viermal, um die unbeschrifteten FITC CD31-Zellen aus dem Röhrchen zu entfernen. Entfernen Sie das Durchflussrohr vom Magneten und resuspendieren Sie die gereinigten CD31-positiven Zellen mit der gewünschten Menge eines geeigneten Mediums.
Reservieren Sie zwei 10-Mikroliter-Aliquots der Suspension, eines für die Zellzählung und das zweite für die Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse, um die Reinheit von CD31-positiven Zellen in postmagnetisch aktivierten Zellsortierproben zu beurteilen. Entfernen Sie das HECSR-Medium von den Six-Well-Platten, die endotheliale und nicht-endotheliale Zellpopulationen enthalten. Geben Sie dann einen Milliliter Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung.
Beobachten Sie die Zellmorphologie sorgfältig unter dem Mikroskop. Wenn die Endothelzellen hell und rund erscheinen, in der Regel innerhalb von zwei bis fünf Minuten, lösen Sie sie, indem Sie auf den Rand der Platte klopfen. Die nicht-endothelialen Zellen bleiben an der Platte haften.
Sammeln Sie die abgelösten Endothelzellen vorsichtig mit einer Mikropipette, ohne die Nicht-Endothelzellen zu stören, und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das vier Milliliter DMEM/F-12 10 pro Milliliter Dissoziationsreagenz enthält. Geben Sie dann zwei Milliliter HECSR-Medium in die Vertiefungen, die die verbleibenden anhaftenden nicht-endothelialen Zellen enthalten, um die glatten muskelähnlichen Zellen oder SMLCs zu etablieren, und legen Sie die Platte in den Inkubator. Übertragen Sie die Endothelzellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
Gründlich mischen und 10 Mikroliter der Suspension für die Zellzählung reservieren. Die restlichen Zellen bei 200 g für fünf Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius zentrifugieren. Dann zwei Milliliter HECSR-Medium hinzufügen.
Als nächstes entfernst du das Kollagen für die Lösung aus einer zuvor vorbereiteten kollagenkodierten Sechs-Well-Platte und gibst zwei Milliliter der Endothelzellsuspension in jede Well. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Die immunfluoreszierende Färbung von EECM-BMEC-ähnlichen Zelljunktionalmolekülen unter Einbeziehung von Claudin-5, Occludin und VE-Cadherin wurde verwendet, um die Zellmorphologie und das Vorhandensein kontinuierlicher und reifer Verbindungen zu untersuchen.
Die Stimulation der EECM-BMEC-ähnlichen Zellen, die auf Kammerobjektträgern ausgesät wurden, mit proinflammatorischen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor alpha und Interferon gamma, verdünnt in SMLC-abgeleitetem konditioniertem Medium, erhöhte die Expression von Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 und VCAM-1. Repräsentative Bilder von Markern für glatte Muskelzellen, einschließlich Alpha-Aktin der glatten Muskulatur, Calponin und glattem Muskelprotein 22 alpha, werden hier gezeigt. Die Stimulation der EECM-BMEC-ähnlichen Zellen mit pro-inflammatorischen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor alpha und Interferon gamma erhöhte die Zelloberflächenexpression verschiedener Adhäsionsmoleküle, darunter ICAM-1, VCAM-1 und P-Selektin.
Darüber hinaus erhöhte die Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen auch die Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen und förderte die erhöhte Anzahl von Immunzellen, die an EECM-BMEC-ähnlichen Zellmonoschichten adhäsierten. EECM-BMEC-ähnliche Zellen sind auch vielversprechend für ein tiefgreifendes Verständnis pathophysiologischer Mechanismen auf der Ebene der Blut-Hirn-Schranke und als wertvolles Werkzeug zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Stabilisierung der Blut-Hirn-Schranke.
