يمكن أن يكون عداد الخلايا لجراثيم Bacillus subtilis باستخدام الطرق التقليدية مهمة شاقة ، حيث يمكن أن تكون هذه الطرق يدوية تماما ودقتها اعتمادا على خبرة المشغل. هذا البروتوكول يجعل تعداد الجراثيم الخاملة والنابتة ممكنا. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح هذه التقنية أيضا تحديد النسبة المئوية للتعامل مع البروتينات الفلورية على سطحه.
بالنظر إلى خطوة الإعداد الموجودة في هذا البروتوكول ، توضح الرؤية مع المرافق والفهم الفني وتفاصيل الرعاية في هذا التنفيذ. ابدأ بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس الخلايا. في مساحة عمل البرنامج ، حدد Cytometer ، متبوعا ب Fluidic Startup.
ثم اختر أوضاع التنظيف. وأخيرا ، ابدأ SIT Flush. خذ 50 ميكرولترا من جراثيم الأوتوكلاف واحتضانها ببروميد الإيثيديوم بعامل تخفيف بنسبة 0.05٪ حجم من حيث الحجم لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
اغسل الجراثيم ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي عند 17،949 جم لمدة 10 دقائق ، وإعادة التعليق في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الخرز باتباع توصيات الشركة المصنعة للتخفيف وتحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحديد استراتيجية البوابات بناء على الخصائص المورفومترية والفلورية للجسيمات باستخدام التحكم السلبي كمرجع.
ثم امزج الأنبوب برفق. قم بإرفاقه بمسبار مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق اكتساب. لضبط طاقة الليزر ، انتقل إلى علامة تبويب المعلمات في نافذة مقياس الخلايا ، واضبط التشتت الأمامي على 375 والتشتت الجانبي على 275.
ثم حدد علامة تبويب العتبة واضبطها على 500. بعد ذلك ، قم بتحليل العينة الخالية من الصبغة التي تحتوي على جراثيم فقط للتخلص من التألق الذاتي. في علامة تبويب المعلمة ، اضبط الفولتية الثلاثة لكاشف المرشح إلى 603 وجهد كاشف المرشح خمسة إلى 538 للتمييز بين المجموعات السكانية السالبة والموجبة باستخدام مضان في عناصر التحكم.
ثم انقر فوق التعويض ، وقم بتعيين كاشف المرشح 5 × 3 إزاحة الإعداد إلى واحد. لتكوين الجهاز للاكتساب، حدد تجربة، واختر تخطيط التجربة واضبط عملية الاستحواذ على 30،000 حدث. بعد ضبط المعلمات ، احصل على بيانات للعينات المصنفة والتي تحتوي على حبات في مقياس التدفق الخلوي.
أجهزة الطرد المركزي 50 ميكرولتر من الجراثيم في 17،949 غرام لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أعد تعليق الجراثيم باستخدام 25 ميكرولتر من 1-إيثيل -3-3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل كاربوديميد واحتضانها لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من N-hydroxysulfosuccinimide بتركيز 50 مليمولار إلى معلق البوغ.
احتضان تعليق بوغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الجراثيم ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. أضف البروتين الفلوري إلى العينات واحتضانها طوال الليل عند 15 درجة مئوية.
أضف 10 ملليغرام لكل ملليلتر من بروميد الإيثيديوم المخفف من 1 إلى 50 ، ثم اترك العينات على الجليد لمدة ساعة واحدة ، محمية من الضوء. بعد غسل الجراثيم وتحديد البوابات كما هو موضح سابقا ، قم بتغيير معلمات كاشف المرشح ثلاثة على المحور x ، وكاشف المرشح خمسة على المحور Y للمخطط النقطي. اكتشفت طريقة عد حبات الخرز مرتين في 10 إلى الجراثيم الثالثة لكل ميكرولتر في عينات أبواغ الأوتوكلاف.
وأظهر تلطيخ بروميد الإيثيديوم لعينات أبواغ الأوتوكلاف متوسط كثافة مضان أعلى من تلطيخ الجراثيم غير المعقم، مما يشير إلى تلطيخ أكبر للمادة الوراثية. أظهر سطح أبواغ الأوتوكلاف ، إلى جانب الجسم المضاد للإنترلوكين 10 المسمى APC ، كفاءة اقتران أكبر مقارنة بالجراثيم غير المعقم. يشير وجود جراثيم نفاذة لبروميد الإيثيديوم إلى احتمال وجود جراثيم نابتة في إجمالي السكان.
استنادا إلى تحليلات قياس التدفق الخلوي ، لوحظ أن الجسم المضاد الفلوري أظهر نسبة أعلى من الاقتران مع الجراثيم الخاملة مقارنة بالجراثيم النابتة. علاوة على ذلك ، مع زيادة تركيز الأجسام المضادة الفلورية ، لوحظت زيادة في النسبة المئوية للجراثيم المقترنة ومتوسط شدة التألق. من المهم إجراء تجانس شامل للخرز الحالي لضمان قراءات دقيقة من خلال قياس التدفق الخلوي والتعداد الدقيق للجراثيم.
توحيد تركيز المستضدات المرتبطة بالجراثيم ، تحلل الدراسات الكندية استخدام البوغ كأجسام مضادة للقاح.
