Il contatore di cellule di spore di Bacillus subtilis con metodi tradizionali può essere un compito laborioso, poiché questi metodi possono essere completamente manuali e la loro precisione dipende dall'esperienza dell'operatore. Questo protocollo rende possibile l'enumerazione delle spore dormienti e in germinazione. Inoltre, la tecnica consente anche di determinare la percentuale di coping delle proteine fluorescenti sulla sua superficie.
Data la fase di configurazione presente in questo protocollo, la visione dimostra con le strutture e la comprensione tecnica e il dettaglio della cura in questa esecuzione. Inizia accedendo al software del citometro. Nell'area di lavoro del software, selezionare Citometro, seguito da Avvio fluidico.
Quindi scegli Modalità di pulizia. E infine, avvia SIT Flush. Prelevare 50 microlitri di spore in autoclave e incubarle con bromuro di etidio a un fattore di diluizione dello 0,05% volume per volume per 30 minuti al riparo dalla luce.
Lavare le spore tre volte con PBS centrifugando a 17.949 G per 10 minuti e risospendendo in PBS. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di perline seguendo le raccomandazioni del produttore per la diluizione e analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso. Definire la strategia di gating in base alle caratteristiche morfometriche e di fluorescenza delle particelle utilizzando come riferimento il controllo negativo.
Quindi mescolare delicatamente il tubo. Collegarlo alla sonda del citometro a flusso e fare clic su Acquisisci. Per impostare la potenza del laser, vai alla scheda dei parametri nella finestra del citometro, regola la dispersione in avanti a 375 e la dispersione laterale a 275.
Quindi selezionare la scheda Soglia e impostarla su 500. Successivamente, analizzare il campione privo di colorante contenente solo spore per eliminare l'autofluorescenza. Nella scheda dei parametri, regolare le tensioni del rivelatore di filtri tre su 603 e le tensioni del rivelatore di filtri cinque su 538 per distinguere tra popolazioni negative e positive utilizzando la fluorescenza nei controlli.
Quindi fare clic su Compensazione e impostare l'offset di impostazione del rilevatore di filtri 5 per 3 su uno. Per configurare il dispositivo per l'acquisizione, selezionare Esperimento, scegliere il layout dell'esperimento e impostare l'acquisizione su 30.000 eventi. Dopo aver regolato i parametri, acquisire i dati per i campioni etichettati e contenenti microsfere nel citometro a flusso.
Centrifugare 50 microlitri di spore a 17,949 G per 10 minuti. Successivamente, risospendere le spore utilizzando 25 microlitri di 1-etil-3-3-dimetilamminopropil carbodiimmide e incubare per 15 minuti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di N-idrossisolfosuccinimide a una concentrazione di 50 millimolari alla sospensione di spore.
Incubare la sospensione di spore a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le spore tre volte con PBS centrifugando come mostrato in precedenza. Aggiungere proteine fluorescenti ai campioni e incubare per una notte a 15 gradi Celsius.
Aggiungere 10 milligrammi per millilitro di bromuro di etidio diluito da 1 a 50, quindi lasciare i campioni su ghiaccio per un'ora, al riparo dalla luce. Dopo aver lavato le spore e definito i gate come mostrato in precedenza, modificare i parametri per il rilevatore di filtri tre sull'asse x e il rilevatore di filtri cinque sull'asse Y del dot plot. Il metodo delle perle di conteggio ha rilevato due volte 10 al terzo spore per microlitro nei campioni di spore in autoclave.
Una colorazione al bromuro di etidio di campioni di spore in autoclave ha mostrato un'intensità di fluorescenza media più elevata rispetto alla colorazione di spore non sterilizzate in autoclave, indicando una maggiore colorazione del materiale genetico. La superficie delle spore dell'autoclave, accoppiata con l'anticorpo anti-interleuchina 10 umana marcato APC, ha mostrato una maggiore efficienza di accoppiamento rispetto alle spore non sterilizzate in autoclave. La presenza di spore permeabili al bromuro di etidio indicava la possibile presenza di spore germinate nella popolazione totale.
Sulla base delle analisi di citometria a flusso, è stato osservato che l'anticorpo fluorescente mostrava una percentuale maggiore di accoppiamento con le spore dormienti rispetto a quelle germinate. Inoltre, all'aumentare della concentrazione di anticorpi fluorescenti, è stato osservato un aumento della percentuale di spore accoppiate e dell'intensità media della fluorescenza. È importante eseguire un'accurata omogeneizzazione delle perle di corrente per garantire letture precise attraverso la citometria a flusso e l'enumerazione accurata delle spore.
Standardizzando la concentrazione di antigeni attaccati alle spore, gli studi canadesi analizzano l'uso delle spore come anticorpi vaccinali.
