Подсчет клеток спор Bacillus subtilis традиционными методами может быть трудоемкой задачей, так как эти методы могут быть полностью ручными, а их точность зависит от опыта оператора. Этот протокол делает возможным перечисление спящих и прорастающих спор. Кроме того, методика также позволяет определить процент совладания флуоресцентных белков на его поверхности.
Учитывая этап настройки, присутствующий в этом протоколе, видение демонстрирует оборудование, техническое понимание и детализацию ухода в этом исполнении. Начните с входа в программное обеспечение цитометра. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр, а затем Жидкостный запуск.
Затем выберите «Режимы очистки». И, наконец, инициируйте SIT Flush. Возьмите 50 микролитров спор автоклава и инкубируйте их с бромидом этидия при коэффициенте разбавления 0,05% по объему в течение 30 минут в защищенном от света месте.
Споры трижды промывают ПБС центрифугированием при 17 949 G в течение 10 минут и повторно суспендируют в ПБС. Далее добавляют 10 микролитров шариков, следуя рекомендациям производителя по разведению, и анализируют пробу с помощью проточного цитометра. Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик частиц, используя отрицательный контроль в качестве эталона.
Затем аккуратно перемешайте трубочку. Прикрепите его к зонду проточного цитометра и нажмите кнопку Получить. Чтобы установить мощность лазера, перейдите на вкладку параметров в окне цитометра, отрегулируйте прямое рассеяние на 375 и боковое рассеяние на 275.
Затем выберите вкладку «Порог» и установите его на 500. Далее анализируют свободный от красителя образец, содержащий только споры, чтобы исключить автофлуоресценцию. На вкладке параметров отрегулируйте напряжение детектора фильтра 3 на 603 и напряжение детектора фильтра 5 на 538, чтобы различать отрицательную и положительную популяцию с помощью флуоресценции в контрольных элементах.
Затем нажмите «Компенсация» и установите смещение настройки детектора фильтра 5 на 3 равным единице. Чтобы настроить устройство для сбора, выберите Эксперимент, выберите макет эксперимента и задайте для сбора данных 30 000 событий. После настройки параметров в проточном цитометре получают данные для образцов, которые маркированы и содержат гранулы.
Центрифугируют 50 микролитров спор при 17 949 Г в течение 10 минут. Далее повторно суспендируют споры с помощью 25 микролитров 1-этил-3-3-диметиламинопропилкарбодиимида и инкубируют в течение 15 минут. После этого добавляют к споровой суспензии 25 микролитров N-гидроксисульфосукцинимида в концентрации 50 миллимоляров.
Выдерживают споровую суспензию при комнатной температуре в течение 30 минут. Промойте споры три раза PBS центрифугированием, как показано ранее. Добавьте флуоресцентный белок к образцам и инкубируйте в течение ночи при температуре 15 градусов Цельсия.
Добавьте 10 миллиграммов на миллилитр бромида этидия, разбавленного в соотношении 1 к 50, затем оставьте образцы на льду на один час, защищенный от света. После промывки спор и определения вентилей, как показано ранее, измените параметры для детектора фильтра три по оси x и детектора фильтра пять по оси Y точечного графика. Методом подсчета шариков в образцах спор в автоклаве выявляли от двух раз по 10 до трети спор на микролитр.
Окрашивание образцами спор в автоклаве бромидом этидия показало более высокую среднюю интенсивность флуоресценции, чем окрашивание неавтоклавных спор, что указывает на большее окрашивание генетического материала. Поверхность спор автоклава в сочетании с меченым APC антителом к интерлейкину 10 показала большую эффективность связывания по сравнению с неавтоклавными спорами. Наличие спор, проницаемых для бромида этидия, указывало на возможное присутствие проросших спор в общей популяции.
На основании анализа методом проточной цитометрии было отмечено, что флуоресцентное антитело показало более высокий процент связывания со спящими спорами по сравнению с проросшими. Более того, по мере увеличения концентрации флуоресцентных антител наблюдалось увеличение процента связанных спор и средней интенсивности флуоресценции. Важно выполнить тщательную гомогенизацию текущих шариков, чтобы обеспечить точные показания с помощью проточной цитометрии и точного подсчета спор.
Стандартизируя концентрацию антигенов, прикрепленных к спорам, канадские исследования анализируют использование спор в качестве вакцинных антител.
