Geleneksel yöntemler kullanılarak Bacillus subtilis sporlarının hücre sayacı zahmetli bir iş olabilir, çünkü bu yöntemler tamamen manuel olabilir ve doğrulukları operatörün deneyimine bağlı olabilir. Bu protokol, hareketsiz ve çimlenen sporların sayımını mümkün kılar. Ek olarak, teknik, yüzeyindeki floresan proteinlerin başa çıkma yüzdesini belirlemeyi de mümkün kılar.
Bu protokolde yer alan kurulum adımı göz önüne alındığında, vizyon, tesisler ve teknik anlayış ve bu uygulamadaki özenin detayı ile gösterilmektedir. Sitometre yazılımına giriş yaparak başlayın. Yazılım çalışma alanında Sitometre'yi ve ardından Fluidic Startup'ı seçin.
Ardından Temizleme Modları'nı seçin. Ve son olarak, SIT Flush'ı başlatın. 50 mikrolitre otoklav sporu alın ve bunları ışıktan korunarak 30 dakika boyunca hacimce% 0.05 seyreltme faktöründe etidyum bromür ile inkübe edin.
Sporları 17.949 G'de 10 dakika santrifüjleyerek ve PBS'de tekrar süspanse ederek PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, üreticinin seyreltme önerilerini izleyerek 10 mikrolitre boncuk ekleyin ve numuneyi bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. Negatif kontrolü referans olarak kullanarak parçacıkların morfo-metrik ve floresan özelliklerine dayalı geçit stratejisini tanımlayın.
Ardından tüpü yavaşça karıştırın. Akış sitometresi probuna takın ve Al'a tıklayın. Lazer gücünü ayarlamak için, sitometre penceresindeki parametreler sekmesine gidin, ileri saçılımı 375'e ve yan saçılımı 275'e ayarlayın.
Ardından eşik sekmesini seçin ve 500 olarak ayarlayın. Ardından, otofloresansı ortadan kaldırmak için yalnızca sporları içeren boyasız numuneyi analiz edin. Parametre sekmesinde, kontrollerde floresan kullanarak negatif ve pozitif popülasyonları ayırt etmek için filtre dedektörü üçünün voltajlarını 603'e ve filtre dedektörü beşin voltajlarını 538'e ayarlayın.
Ardından Telafiye'ye tıklayın ve filtre dedektörü 5'e 3 kurulum ofsetini bire ayarlayın. Cihazı alım için yapılandırmak üzere Deneme'yi seçin, deneme düzenini seçin ve alımı 30.000 olay olarak ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra, akış sitometresinde etiketlenmiş ve boncuk içeren numuneler için veri alın.
50 mikrolitre sporu 17.949 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, 25 mikrolitre 1-etil-3-3-dimetilaminopropil karbodiimid kullanarak sporları tekrar askıya alın ve 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, spor süspansiyonuna 50 milimolar konsantrasyonda 25 mikrolitre N-hidroksisülfosüksinimid ekleyin.
Spor süspansiyonunu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Sporları daha önce gösterildiği gibi santrifüj ederek PBS ile üç kez yıkayın. Numunelere floresan protein ekleyin ve gece boyunca 15 santigrat derecede inkübe edin.
1 ila 50 arasında seyreltilmiş etidyum bromür mililitresine 10 miligram ekleyin, ardından numuneleri ışıktan koruyarak bir saat buz üzerinde bırakın. Sporları yıkadıktan ve kapıları daha önce gösterildiği gibi tanımladıktan sonra, nokta grafiğinin x ekseninde filtre dedektörü üç ve Y ekseninde filtre dedektörü beş parametrelerini değiştirin. Sayım boncukları yöntemi, otoklav spor örneklerinde mikrolitre başına iki kez 10 ila üçüncü spor tespit etti.
Otoklav spor örneklerinin etidyum bromür boyaması, otoklavlanmamış sporların boyanmasından daha yüksek ortalama floresan yoğunluğu gösterdi ve bu da genetik materyalin daha fazla boyandığını gösterdi. Otoklav spor yüzeyi, APC etiketli, anti-insan interlökin 10 antikoru ile birleştiğinde, otoklavlanmamış sporlara kıyasla daha fazla eşleşme etkinliği gösterdi. Etidyum bromüre geçirgen sporların varlığı, toplam popülasyonda çimlenmiş sporların olası varlığını göstermiştir.
Akış sitometrisi analizlerine dayanarak, floresan antikorun çimlenmiş olanlara kıyasla hareketsiz sporlarla daha yüksek bir bağlanma yüzdesi gösterdiği gözlendi. Ayrıca, floresan antikorların konsantrasyonu arttıkça, birleştirilmiş sporların yüzdesinde ve ortalama floresan yoğunluğunda bir artış gözlenmiştir. Akış sitometrisi ve sporların doğru sayımı yoluyla hassas okumalar sağlamak için mevcut boncukların kapsamlı bir homojenizasyonunun yapılması önemlidir.
Spora bağlı antijenlerin konsantrasyonunu standartlaştıran Kanada çalışmaları, sporun aşı antikorları olarak kullanımını analiz etmektedir.
