전통적인 방법을 사용하는 Bacillus subtilis 포자의 세포 계수기는 작업자의 경험에 따라 완전히 수작업이 될 수 있고 정확도가 높기 때문에 힘든 작업이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 휴면 및 발아 포자의 열거를 가능하게 합니다. 또한 이 기술을 사용하면 표면에서 형광 단백질의 대처 비율을 결정할 수 있습니다.
이 프로토콜에 있는 설정 단계를 감안할 때 비전은 이 실행에서 시설과 기술적 이해 및 세부 관리를 보여줍니다. 먼저 유세포 분석기 소프트웨어에 로그인합니다. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer를 선택한 다음 Fluidic Startup을 선택합니다.
그런 다음 청소 모드를 선택합니다. 마지막으로 SIT 플러시를 시작합니다. 50 마이크로 리터의 오토 클레이브 포자를 취하여 0.05 %의 희석 계수로 브롬화 에티듐으로 배양하고 30 분 동안 빛으로부터 보호합니다.
17, 949G에서 10분 동안 원심분리하고 PBS에 다시 현탁시켜 포자를 PBS로 세 번 세척합니다. 다음으로, 희석에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 10마이크로리터의 비드를 추가하고 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다. negative control을 참조로 사용하여 입자의 morpho-metric 및 fluorescence 특성을 기반으로 게이팅 전략을 정의합니다.
그런 다음 튜브를 부드럽게 섞습니다. 유세포 분석기 프로브에 부착하고 Acquire(획득)를 클릭합니다. 레이저 출력을 설정하려면 cytometer 창의 parameters 탭으로 이동하여 forward scatter를 375로, side scatter를 275로 조정합니다.
그런 다음 임계값 탭을 선택하고 500으로 설정합니다. 다음으로, 자가형광을 제거하기 위해 포자만 포함된 무염료 샘플을 분석합니다. 파라미터 탭에서 필터 검출기 3의 전압을 603으로, 필터 검출기 5의 전압을 538로 조정하여 대조군의 형광을 사용하여 음성 모집단과 양성 모집단을 구별합니다.
그런 다음 보정(Compensation)을 클릭하고 필터 검출기 5 x 3 설정 오프셋을 1로 설정합니다. 획득을 위해 장치를 구성하려면 실험을 선택하고 실험 레이아웃을 선택한 다음 획득을 30, 000 이벤트로 설정합니다. 파라미터를 조정한 후 유세포 분석기에서 라벨링되고 비드를 포함하는 샘플에 대한 데이터를 수집합니다.
17, 949G에서 포자 50마이크로리터를 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 25 마이크로 리터의 1- 에틸 -3-3- 디메틸 아미노 프로필 카르보디 이미드를 사용하여 포자를 다시 현탁시키고 15 분 동안 배양합니다. 그 후, 포자 현탁액에 50 밀리몰 농도의 N-하이드록시설포숙신이미드 25 마이크로리터를 첨가한다.
포자 현탁액을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 앞과 같이 원심분리하여 PBS로 포자를 세 번 씻습니다. 샘플에 형광 단백질을 추가하고 섭씨 15도에서 밤새 배양합니다.
1에서 50으로 희석한 에티듐 브로마이드 밀리리터당 10mg을 첨가한 다음 샘플을 빛으로부터 보호하여 1시간 동안 얼음 위에 둡니다. 포자를 세척하고 앞과 같이 게이트를 정의한 후 점도표의 x축에서 필터 검출기 3에 대한 파라미터를 변경하고 Y축에서 필터 검출기 5에 대한 파라미터를 변경합니다. 계수 비드 방법은 오토클레이브 포자 샘플에서 마이크로리터당 2배 10에서 3번째 포자를 검출했습니다.
오토클레이브 포자 샘플의 에티듐 브로마이드 염색은 비오토클레이브 포자의 염색보다 평균 형광 강도가 더 높았으며, 이는 유전 물질의 더 큰 염색을 나타냅니다. APC 표지된 항인간 인터루킨 10 항체와 결합된 오토클레이브 포자 표면은 비오토클레이브 포자에 비해 더 큰 결합 효율을 보여주었습니다. 에티듐 브로마이드에 투과할 수 있는 포자의 존재는 전체 개체군에서 발아된 포자의 존재 가능성을 나타냈다.
유세포 분석 분석에 기초하여, 형광 항체는 발아된 포자에 비해 휴면 포자와의 결합 비율이 더 높은 것으로 관찰되었습니다. 또한, 형광 항체의 농도가 증가함에 따라, 결합 포자의 비율과 평균 형광 강도의 증가가 관찰되었다. 유세포 분석과 포자의 정확한 계수를 통해 정확한 판독을 보장하기 위해 현재 비드의 철저한 균질화를 수행하는 것이 중요합니다.
포자에 부착된 항원의 농도를 표준화한 캐나다 연구는 포자를 백신 항체로 사용하는 것을 분석합니다.
