Contador celular de esporos de Bacillus subtilis usando métodos tradicionais pode ser uma tarefa trabalhosa, pois esses métodos podem ser completamente manuais e suas precisões dependendo da experiência do operador. Este protocolo possibilita a enumeração de esporos dormentes e germinativos. Além disso, a técnica também permite determinar a porcentagem de coping de proteínas fluorescentes em sua superfície.
Diante da etapa de setup presente neste protocolo, a visão demonstra com as facilidades e o entendimento técnico e o detalhamento do cuidado nesta execução. Comece fazendo login no software do citômetro. No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro, seguido por Inicialização fluídica.
Em seguida, escolha Modos de limpeza. E, finalmente, inicie o SIT Flush. Tomar 50 microlitros de esporos de autoclave e incubá-los com brometo de etídio a um fator de diluição de 0,05% volume em volume por 30 minutos protegidos da luz.
Lave os esporos três vezes com PBS centrifugando a 17, 949 G por 10 minutos e ressuspendendo em PBS. Em seguida, adicione 10 microlitros de contas seguindo as recomendações do fabricante para diluição e analise a amostra usando um citômetro de fluxo. Definir a estratégia de gating com base nas características morfométricas e de fluorescência das partículas usando o controle negativo como referência.
Em seguida, misture o tubo suavemente. Anexe-o à sonda do citômetro de fluxo e clique em Adquirir. Para definir a potência do laser, vá para a guia de parâmetros na janela do citômetro, ajuste a dispersão para frente para 375 e a dispersão lateral para 275.
Em seguida, selecione a guia limite e defina-a como 500. Em seguida, analise a amostra sem corante contendo apenas esporos para eliminar a autofluorescência. Na guia de parâmetros, ajuste as tensões do detector de filtro três para 603 e as tensões do detector de filtro cinco para 538 para diferenciar entre populações negativas e positivas usando fluorescência nos controles.
Em seguida, clique em Compensação e defina o deslocamento de configuração do detector de filtro 5 por 3 como um. Para configurar o dispositivo para aquisição, selecione Experimentar, escolha o layout do experimento e defina a aquisição como 30.000 eventos. Após o ajuste dos parâmetros, adquira dados para as amostras que são rotuladas e contêm contas no citômetro de fluxo.
Centrifugar 50 microlitros de esporos a 17, 949 G por 10 minutos. Em seguida, ressuspender os esporos usando 25 microlitros de carbodiimida 1-etil-3-3-dimetilaminopropil e incubar por 15 minutos. Em seguida, adicionar 25 microlitros de N-hidroxisulfosuccinimida a uma concentração de 50 milimolares à suspensão de esporos.
Incubar a suspensão de esporos à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave os esporos três vezes com PBS centrifugando, como mostrado anteriormente. Adicione proteína fluorescente às amostras e incube durante a noite a 15 graus Celsius.
Adicione 10 miligramas por mililitro de brometo de etídio diluído de 1 a 50 e, em seguida, deixe as amostras no gelo por uma hora, protegidas da luz. Depois de lavar os esporos e definir as comportas como mostrado anteriormente, altere os parâmetros para o detector de filtro três no eixo x e detector de filtro cinco no eixo Y do gráfico de pontos. O método de contagem de esferas detectou duas vezes 10 a terceiro esporos por microlitro em amostras de esporos em autoclave.
A coloração com brometo de etídio nas amostras de esporos em autoclave mostrou maior intensidade média de fluorescência do que a coloração com esporos não autoclavados, indicando maior coloração do material genético. A superfície do esporo da autoclave, juntamente com o anticorpo antileucina 10 marcado com APC, apresentou maior eficiência de acoplamento em relação aos esporos não autoclavados. A presença de esporos permeáveis ao brometo de etídio indicou a possível presença de esporos germinados na população total.
Com base nas análises por citometria de fluxo, observou-se que o anticorpo fluorescente apresentou maior porcentagem de acoplamento com os esporos dormentes em comparação aos germinados. Além disso, à medida que a concentração de anticorpos fluorescentes aumentou, observou-se um aumento na porcentagem de esporos acoplados e na intensidade média da fluorescência. É importante realizar uma homogeneização completa das esferas atuais para garantir leituras precisas através de citometria de fluxo e enumeração precisa de esporos.
Padronizando a concentração de antígenos ligados ao esporos, estudos canadenses analisam o uso de esporos como anticorpos vacinais.
