El contador celular de esporas de Bacillus subtilis mediante métodos tradicionales puede ser una tarea laboriosa, ya que estos métodos pueden ser completamente manuales y sus precisiones dependen de la experiencia del operador. Este protocolo hace posible la enumeración de esporas latentes y germinativas. Además, la técnica también permite determinar el porcentaje de cofia de proteínas fluorescentes en su superficie.
Dado el paso de configuración presente en este protocolo, la visión se demuestra con las instalaciones y la comprensión técnica y el detalle del cuidado en esta ejecución. Comience iniciando sesión en el software del citómetro. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro y, a continuación, Inicio fluídico.
A continuación, elija Modos de limpieza. Y, por último, inicie SIT Flush. Tomar 50 microlitros de esporas de autoclave e incubarlas con bromuro de etidio a un factor de dilución de 0,05% volumen por volumen durante 30 minutos protegidos de la luz.
Lavar las esporas tres veces con PBS centrifugando a 17,949 G durante 10 minutos y volviendo a suspender en PBS. A continuación, agregue 10 microlitros de perlas siguiendo las recomendaciones del fabricante para la dilución y analice la muestra con un citómetro de flujo. Definir la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de las partículas utilizando como referencia el control negativo.
A continuación, mezcle el tubo suavemente. Conéctelo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic en Adquirir. Para configurar la potencia del láser, vaya a la pestaña de parámetros en la ventana del citómetro, ajuste la dispersión frontal a 375 y la dispersión lateral a 275.
A continuación, seleccione la pestaña de umbral y configúrela en 500. A continuación, analice la muestra sin colorante que contiene solo esporas para eliminar la autofluorescencia. En la pestaña de parámetros, ajuste los voltajes del detector de filtro tres a 603 y los voltajes del detector de filtro cinco a 538 para diferenciar entre poblaciones negativas y positivas utilizando fluorescencia en los controles.
A continuación, haga clic en Compensación y establezca el desplazamiento de configuración del detector de filtro de 5 por 3 en uno. Para configurar el dispositivo para la adquisición, seleccione Experimento, elija el diseño del experimento y establezca la adquisición en 30.000 eventos. Después de ajustar los parámetros, adquiera datos para las muestras que están etiquetadas y contienen perlas en el citómetro de flujo.
Centrifugar 50 microlitros de esporas a 17.949 G durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender las esporas con 25 microlitros de 1-etil-3-3-dimetilaminopropilcarbodiimida e incube durante 15 minutos. Posteriormente, agregue 25 microlitros de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de 50 milimolares a la suspensión de esporas.
Incuba la suspensión de esporas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave las esporas tres veces con PBS centrifugando como se muestra anteriormente. Agregue proteína fluorescente a las muestras e incube durante la noche a 15 grados centígrados.
Agregue 10 miligramos por mililitro de bromuro de etidio diluido de 1 a 50, luego deje las muestras en hielo durante una hora, protegidas de la luz. Después de lavar las esporas y definir las puertas como se muestra anteriormente, cambie los parámetros para el detector de filtro tres en el eje x y el detector de filtro cinco en el eje Y del diagrama de puntos. El método de conteo de perlas detectó dos veces 10 a la tercera esporas por microlitro en muestras de esporas de autoclave.
Una tinción con bromuro de etidio de muestras de esporas de autoclave mostró una mayor intensidad de fluorescencia media que la tinción de esporas no esterilizadas en autoclave, lo que indica una mayor tinción de material genético. La superficie de las esporas del autoclave, junto con el anticuerpo anti-interleucina 10 humana marcado con APC, mostró una mayor eficiencia de acoplamiento en comparación con las esporas no esterilizadas en autoclave. La presencia de esporas permeables al bromuro de etidio indicó la posible presencia de esporas germinadas en la población total.
Con base en los análisis de citometría de flujo, se observó que el anticuerpo fluorescente mostró un mayor porcentaje de acoplamiento con las esporas latentes en comparación con las germinadas. Además, a medida que aumentaba la concentración de anticuerpos fluorescentes, se observaba un aumento en el porcentaje de esporas acopladas y en la intensidad media de fluorescencia. Es importante realizar una homogeneización exhaustiva de las perlas de corriente para garantizar lecturas precisas a través de la citometría de flujo y la enumeración precisa de las esporas.
Estandarizando la concentración de antígenos adheridos a la espora, los estudios canadienses analizan el uso de esporas como anticuerpos de la vacuna.
