Der Zellzähler von Bacillus subtilis-Sporen mit herkömmlichen Methoden kann eine mühsame Aufgabe sein, da diese Methoden vollständig manuell durchgeführt werden können und ihre Genauigkeit von der Erfahrung des Bedieners abhängt. Dieses Protokoll ermöglicht die Zählung von ruhenden und keimenden Sporen. Darüber hinaus ermöglicht die Technik auch die Bestimmung des prozentualen Anteils fluoreszierender Proteine auf ihrer Oberfläche.
Angesichts des Einrichtungsschritts, der in diesem Protokoll enthalten ist, demonstriert die Vision mit den Einrichtungen und dem technischen Verständnis und den Details der Pflege in dieser Ausführung. Melden Sie sich zunächst bei der Zytometer-Software an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software Zytometer und dann Fluidic Start aus.
Wählen Sie dann Reinigungsmodi aus. Und schließlich initiieren Sie SIT Flush. Nehmen Sie 50 Mikroliter Autoklavsporen und inkubieren Sie sie mit Ethidiumbromid bei einem Verdünnungsfaktor von 0,05 Vol.-% für 30 Minuten vor Licht geschützt.
Waschen Sie die Sporen dreimal mit PBS, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 17,949 g zentrifugieren und wieder in PBS suspendieren. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Kügelchen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zur Verdünnung hinzu und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer. Definieren Sie die Anschnittstrategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften der Partikel unter Verwendung der Negativkontrolle als Referenz.
Dann die Tube vorsichtig mischen. Schließen Sie es an die Durchflusszytometersonde an und klicken Sie auf Erfassen. Um die Laserleistung einzustellen, gehen Sie auf die Registerkarte "Parameter" im Zytometerfenster, stellen Sie die Vorwärtsstreuung auf 375 und die Seitenstreuung auf 275 ein.
Wählen Sie dann die Registerkarte Schwellenwert aus, und legen Sie ihn auf 500 fest. Analysieren Sie als Nächstes die farbstofffreie Probe, die nur Sporen enthält, um Autofluoreszenz zu eliminieren. Stellen Sie auf der Registerkarte "Parameter" die Spannungen des Filterdetektors drei auf 603 und die Spannungen des Filterdetektors fünf auf 538 ein, um mithilfe der Fluoreszenz in den Kontrollen zwischen negativen und positiven Populationen zu unterscheiden.
Klicken Sie dann auf Kompensation und setzen Sie den Setup-Offset des Filterdetektors 5 x 3 auf eins. Um das Gerät für die Erfassung zu konfigurieren, wählen Sie Experiment aus, wählen Sie das Experimentlayout aus, und legen Sie die Erfassung auf 30.000 Ereignisse fest. Nachdem Sie die Parameter angepasst haben, erfassen Sie Daten für die Proben, die markiert sind und Kügelchen im Durchflusszytometer enthalten.
Zentrifugieren Sie 50 Mikroliter Sporen bei 17.949 g für 10 Minuten. Anschließend werden die Sporen mit 25 Mikrolitern 1-Ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimid resuspendiert und 15 Minuten lang inkubiert. Danach werden 25 Mikroliter N-Hydroxysulfosuccinimid in einer Konzentration von 50 Millimolar zur Sporensuspension gegeben.
Die Sporensuspension 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Sporen dreimal mit PBS, indem Sie sie wie oben gezeigt zentrifugieren. Geben Sie fluoreszierendes Protein zu den Proben und inkubieren Sie über Nacht bei 15 Grad Celsius.
Fügen Sie 10 Milligramm pro Milliliter Ethidiumbromid hinzu, das bei 1 bis 50 verdünnt ist, und lassen Sie die Proben dann eine Stunde lang lichtgeschützt auf Eis. Nachdem Sie die Sporen gewaschen und die Gates wie zuvor gezeigt definiert haben, ändern Sie die Parameter für den Filterdetektor drei auf der x-Achse und den Filterdetektor fünf auf der Y-Achse des Punktdiagramms. Die Methode der Zählperlen detektierte zwei mal 10 bis dritte Sporen pro Mikroliter in Autoklaven-Sporenproben.
Eine Ethidiumbromid-Färbung von Autoklaven-Sporenproben zeigte eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität als die Färbung von nicht autoklavierten Sporen, was auf eine stärkere Färbung des genetischen Materials hindeutet. Die Sporenoberfläche des Autoklaven, gekoppelt mit dem APC-markierten, anti-humanen Interleukin-10-Antikörper, zeigte im Vergleich zu den nicht autoklavierten Sporen eine höhere Kopplungseffizienz. Das Vorhandensein von Sporen, die für Ethidiumbromid durchlässig sind, deutete auf das mögliche Vorhandensein von gekeimten Sporen in der Gesamtpopulation hin.
Basierend auf den durchflusszytometrischen Analysen konnte beobachtet werden, dass der fluoreszierende Antikörper im Vergleich zu den gekeimten Sporen einen höheren Prozentsatz der Kopplung mit den ruhenden Sporen aufwies. Darüber hinaus wurde mit zunehmender Konzentration von Fluoreszenzantikörpern ein Anstieg des Prozentsatzes der gekoppelten Sporen und der mittleren Fluoreszenzintensität beobachtet. Es ist wichtig, eine gründliche Homogenisierung der aktuellen Kügelchen durchzuführen, um präzise Messwerte durch Durchflusszytometrie und genaue Zählung der Sporen zu gewährleisten.
Kanadische Studien standardisieren die Konzentration von Antigenen, die an die Sporen gebunden sind, und analysieren die Verwendung von Sporen als Impfantikörper.
