Bu çalışma, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) araştırma fonundan bir hibe ve Start2Cure'dan (0-TI-01) bir hibe ile desteklenmiştir. Protokolün kurulumundaki katkıları ve tavsiyeleri için Leisha Kopp'a teşekkür ederiz. Figürler Biorender kullanılarak oluşturuldu.

Tüm deneysel prosedürler, Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin (KNAW) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı ve AVD8010020199126 numaralı proje kapsamında Hollanda Hayvan Deneyleri Yasası'na uygundu. Şekil 1'de, protokolün tamamına şematik bir genel bakış sağlanmıştır. Tohumlama hücrelerinden AAV saflaştırmasına kadar, protokolün tamamlanması 6 gün sürer.
1. Reaktif hazırlama
<ol><li>Plazmit saflaştırma<ol><li>Plazmitlerin sterilitesini sağlamak için birkaç ayarlama ile üretici tarafından tarif edildiği gibi plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.</li>
		<li>Steril damıtılmış su ve mutlak etanol kullanarak% 70 etanol hazırlayın.</li>
		<li>İzopropanol santrifüj adımından sonra, akış kabini davlumbazındaki plazmitleri kurutun ve tüplere steril %70 etanol ekleyin. Etanol çökeltildikten sonra, plazmitleri akış kabini davlumbazında kurutun ve plazmiti steril damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüpleri kullanmaya özen gösterin.</li>
		<li>Niceleme, kısıtlama analizi ve gerekirse sıralama için bir alikot alın. Mutasyonların verim üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden, ters çevrilmiş terminal tekrarlarının (ITR'ler) bütünlüğünün kontrol edilmesi tavsiye edilir. Numune konsantrasyonunu 1 μg/μL'ye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>10x Tween lizis tamponunun hazırlanması<ol><li>30.3 g Tris tamponu ve 2.033 g MgCl2.6H 2O'yu 400mL steril damıtılmış suda çözün, pH'ı 8.0'a ayarlayın ve toplam hacmi 450 mL'ye yükseltin.</li>
		<li>Tween 20'yi steril tutun, davlumbazdaki tampon solüsyona 50 mL Tween 20 ekleyin ve 0,2 μM vakum filtresi kullanarak filtre sterilizasyonu yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>İodiksanol dilüsyonları<ol><li>İodiksanol çözeltisi% 60 konsantrasyonda sağlanır. %15, %25 ve %40 çözümler yapmak için başlangıç çözümünü kullanın.</li>
		<li>% 15'lik çözelti için, 60 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL 5 M NaCl ve 48 mL PBS-MK (5 mM MgCl2 ve 12.5 mM KCl ile 5x PBS) ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>% 25 çözelti için, 67 mL% 60 çözelti ve 32 mL PBS-MK seyreltin. 160 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. İyice karıştırın ve 1.6 mL fenol kırmızısı çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>% 40'lık çözelti için, 160 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL PBS-MK ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. % 60 çözelti için, 100 mL % 60 çözeltiye 1 mL fenol kırmızısı ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>PBS %5 sükroz çözeltisi<ol><li>Kalsiyum veya magnezyum içermeyen 500 mL'lik bir DPBS şişesine 25 g sükroz ekleyin. İyice çalkalayın ve 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak filtreleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Polietilen glikol (PEG) 8000 çözeltisi<ol><li>400 g PEG 8000 ve 24 g NaCl'yi steril damıtılmış suda çözün ve 1000 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Tamamen eriyene kadar ısıtarak karıştırın. pH kağıdı kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.</li>
		<li>Filtre, %40 PEG 8000 çözeltisi elde etmek için 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak sterilize edilir. Çözelti deposunun 4 °C'deki viskozitesi nedeniyle filtrelemenin biraz zaman alacağını unutmayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HEK293 süspansiyon hücrelerinin kültürü
<ol><li>Temizlik için %70 etanole batırılmış mendiller kullanın. Biyogüvenlik kapağını temizleyin, hücrelerin kültürlenmesi için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın ve temizleyin.</li>
	<li>50 mL'lik bir konik kültür tüpünde 30 mL süspansiyon hücresi ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Viral üretim hücrelerini sıvı nitrojenden alın. Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Flakon tamamen çözülmeden hemen önce, %70 etanole batırılmış bir mendille temizleyin ve flakonu biyogüvenlik başlığına aktarın. NOT: Burada kullanılan viral üretim hücrelerinin detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.</li>
	<li>Hücreleri önceden ısıtılmış 50 mL'lik konik kültür tüpüne hızlı bir şekilde aktarın. 37 °C, %80 nem, %8 CO2, dakikada 200 devir (RPM) ve 50 mm çalkalama çapı olan çalkalama inkübatörlerinde kültür hücreleri. Geçiş hücreleri, canlılık% 90'ın üzerinde olduğunda ve hücre yoğunluğu 1-3 x 106 hücre / mL'nin üzerinde olduğunda. NOT: Kullanılan inkübatörün çalkalama çapı 50 mm'dir; Kültür koşulları, farklı bir çalkalama çapı için ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Çözüldükten 3-4 gün sonra geçiş hücreleri. Kontaminasyon belirtisi olmadığından emin olmak için kültür tüplerini kontrol edin; Örneğin, mantar renksiz (siyah veya yeşil) bir halka olarak görünecektir.</li>
	<li>1 mL'lik bir şerit kullanarak numune başına 400 μL %0.4 tripan mavisi çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Süspansiyon hücrelerini inkübatörden hızlı bir şekilde alın. Hemen 1 mL'lik bir şerit kullanarak tüpten 500 μL çıkarın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hazırlanan tripan mavisi tüpe 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin; Hücre ölümüne yol açacağından karıştırmak için pipet yapmayın. Hücreleri inkübatöre geri döndürün.</li>
	<li>50 μL tripan mavisi ile muamele edilmiş hücre süspansiyonu alın ve hemositometre lamına uygulayın. Toplam canlı hücreleri sayın ve ertesi gün geçiş veya transfeksiyon için gereken hücre süspansiyonu ve ortam miktarını hesaplayın.</li>
	<li>İnkübatörde 10-15 dakika ılık ortam. Isıtılmış ortama hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübatöre geri dönün. 3 gün boyunca (yani Pazartesi-Perşembe) hücreleri geçirmek için 0,5 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın; 4 gün boyunca (yani Perşembe-Pazartesi) hücreleri geçirmek için 0,3 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın. NOT: Üreticiye göre, viral üretim hücreleri her 26 saatte bir ikiye katlanır ve geçmeden önce 3,5 x 106 ile 5,5 x 106 arasında olmalıdır. Hücreler 20. geçişe kadar saklanabilir.</li>
</ol>3. Transfeksiyon
<ol><li>1. Gün<ol><li>Transfeksiyondan 24 saat önce, 300 mL ortamda / mL başına 1 x 106 hücre kültürleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Sıcak ortam, plazmitler ve transfeksiyon reaktifi oda sıcaklığına. Hazırlanacak miktarlar için Tablo 1'e bakınız.</li>
		<li>Kısaca plazmitleri ve reaktifleri girdaplayın. Hazırlanan ortama, girdaba plazmitler ekleyin. Transfeksiyon reaktifi ekleyin ve kısaca girdap yapın. Bu adımdan sonra karışımı çalkalamayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Bu arada, 1. günde hazırlanan hücreleri sayın. Hücreler mL başına 2 ila 2,5 x 106 hücre arasında olmalı ve > %95 canlı olmalıdır.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra, damla damla transfeksiyon karışımını tüpleri hafifçe döndürürken hücrelere ekleyin. 72-96 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hücrelerin toplanması
<ol><li>5. Gün<ol><li>33 mL 10x hücre lizis tamponu (500 mM Tris pH 8,% 10 Tween 20, 20 mM MgCl2) ekleyin, hafifçe çalkalayarak karıştırın ve 37 ° C'de 1.5 saat çalkalayarak inkübe edin.</li>
		<li>3428 x g'da 4 °C'de 60 dakika santrifüjleyin. Hücre lizatını berraklaştırmak için 0.45 μM PES vakum filtresinden süzün ve arıtılmış lizatı filtrenin kabında bırakın. NOT: Filtrasyondan sonra isteğe bağlı: kantitatif PCR (Q-PCR) için 50 μL numune alın.</li>
		<li>360 mL filtrelenmiş hücre lizatına 90 mL %40 PEG 8000 çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Karıştırma çubuğunu %70 etanol ile temizleyin ve numuneye ekleyin. Buz üzerinde veya soğuk odada 300 RPM'de 1 saat karıştırın. Gece boyunca karıştırmadan 4 °C'de inkübe edin. NOT: 1 saat ila 72 saat arasındaki inkübasyon süreleri test edilmiştir. Daha uzun inkübasyon süreleri, genel protein çökelmesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. İodiksanol saflaştırma
<ol><li>6. Gün<ol><li>PEG çökeltilmiş kültür hacmi numunesinin tamamını temiz, büyük bir konik tüpe aktarın ve 2820 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve PEG peletini kalsiyum ve magnezyum ile 15 mL DPBS'de yeniden süspanse edin. Peletin yeniden askıya alınması zordur; Bunu dikkatli bir şekilde yapmak için zaman ayırın.</li>
		<li>Yeniden askıya alınan parçayı 50 mL'lik temiz bir tüpe aktarın. PEG, biyoreaktör tüpünün yanlarında kalacaktır. Tüm PEG çökeltisini toplamaya dikkat ederek fazladan 10 mL ekleyin. Toplam 25-30 mL hacim için hepsini 50 mL'lik bir kaba aktarın.</li>
		<li>40 μL DNaseI (10 U/μL) ekleyin. 1 saat 37°C'de inkübatöre koyun. NOT: DNaz inkübasyonundan sonra isteğe bağlı: Q-PCR için 50 μL numune alın.</li>
		<li>PEG çökeltme için kullanılan karıştırma çubuklarını klorür çözeltisi ve ardından %70 etanol ile iyice temizleyin. Bir sonraki deney için karıştırma çubuklarını %70 etanol içinde bırakın.</li>
		<li>25 mm x 89 mm'lik bir poliallomer tüpü, her tüpte 15,5 mL konsantre hücre lizatı içeren bir cam Pasteur pipeti kullanarak doldurun. Hücre lizatı ekledikten sonra, cam Pasteur pipetini yenisiyle değiştirin.</li>
		<li>% 15 -% 60 arasında iyodiksanol çözeltileri ekleyin:% 15 iyodiksanol çözeltisinin 9 mL'sini hücre lizatının altına hafifçe infüze edin. Daha sonra, %25 ve %40 iyodiksanol çözeltilerinden 5 mL ekleyin ve son olarak, %60 iyodiksanol çözeltisinden 5 mL ekleyin.</li>
		<li>İodiksanol katmanlarını rahatsız etmemeye dikkat ederek hava kabarcıklarının çoğunu gidermek için DPBS +/+ içeren bir şırınga kullanarak tüpü doldurun. Bir elektrik tüpü kabı kullanarak tüpü kapatın.</li>
		<li>Bir ultrasantrifüjde 16 °C'de 490.000 x g'de 1 saat 10 dakika boyunca sallanmayan bir rotorda santrifüjleyin. Ultrasantrifüjden çıkarın, tüpleri metal bir tokada birleştirin ve toplama tüplerini hazırlayın. Eğirme sırasında dökülme ihtimaline karşı davlumbazdaki rotoru açın.</li>
		<li>Bir adet 50 mL'lik tüp (rotor tüpünü atmak için), bir adet 15 mL'lik tüp (virüs toplamak için), 5 mL'lik bir şırınga ve gradyan başına 30G ve 19G'lik bir iğne hazırlayın.</li>
		<li>30G'lik bir iğne ile tüpün üst kısmında bir delik açın. İğneyi yerinde bırakın. Şırınganın üzerine 19G'lik bir iğne yerleştirin.</li>
		<li>Tüpü, fenol kırmızı göstergesi ile görülebilen %40/%60 arayüzünün hemen altında dikkatlice delin. İğne eğiminin %40'lık katmana baktığından emin olun.</li>
		<li>Baskın olmayan elinizi kullanarak 30G iğnesini tüpün üstünden çıkarın. İğne eğimliyken, virüsü / iyodiksanol'ü yavaşça çıkarın. Amaç 3 mL ile 4.5 mL arasında ekstrakte etmektir. Yaklaşık yarısına kadar ve %40/berrak tabakanın içine, eğimin aşağı bakması için iğneyi döndürün ve protein tabakasından toplanmayı önlemek için çıkarmaya devam edin.</li>
		<li>50 mL'lik tüpü baskın olmayan elinizle hazırlayın, tüpü 50 mL'lik tüpe yerleştirirken iğneyi dikkatlice çıkarın ve atın. AAV / iyodiksanol süspansiyonunu DPBS'de 5 mL'ye kadar doldurarak 15x seyreltin.</li>
		<li>Bir santrifüj filtre tüpüne aktarın ve 3428 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Akışı atın; Filtrenin tutucusunu yavaşça çıkarın ve alt kabı bir atık şişesine koyun. Filtrelemek ve yeniden süspanse etmek için 15 mL PBS-%5 sükroz ekleyin.</li>
		<li>3428 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Arabellek değişimini en az 3 kez tekrarlayın. Virüsü (~150-250 μL) 4 °C'de (PHP. B varyantları maksimum 3 ay) veya alikot 50 μL alikotlar halinde ve uzun süre -80 ° C'de saklayın. BILGINIZE: PHP. B kapsid varyantları donmaya/çözülmeye karşı hassastır, bu nedenle bundan kaçınılmalıdır.</li>
		<li>Titrasyonu önceki protokol10'da açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>

HEK293 Süspansiyon Kültürü Kullanılarak Basitleştirilmiş ve Verimli AAV Üretimi

<ol>
	<li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases.">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).</li><li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration.">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood&#8211;brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system.">Several rAAV vectors efficiently cross the blood&#8211;brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li><li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset.">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960 (2019).</li><li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li><li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy,+methods+and+protocols.">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li><li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addgene+AAV+data+hub:+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data.">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li><li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li><li>Blessing, D., D&#233;glon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells,+methods+and+protocols.">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li></ol>

İlk test için Mirus tarafından ücretsiz bir TransIT numunesi sağlandı ve ardından reaktif daha sonra kullanılmak üzere satın alındı. Yazarların rapor edecek başka bir rakip mali çıkarı yoktur.

AAV'nin sistemik uygulaması, CNS'ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15cm2'lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler taraf?...

Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı1. AAV'ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık2 için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır 1,2,3.
AAV'nin keşfi ile. PHP.B4 ve AAV gibi yeni nesil kapsidler. PHP.eB5 ve AAV. CAP-B106, basit bir sistemik enjeksiyon kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) hedeflemek mümkündür. Uzamsal haritalama, AAV tarafından hedeflenen hücreleri ortaya çıkarır. Hücresel düzeydePHP.eB 6,7. Spesifik promotörler/arttırıcılar ile kombinasyon halinde, bu kapsidler, sinirbilimcilerin non-invaziv AAV iletimi ile genleri ve beyin fonksiyonlarını incelemeleri için kapsamlı fırsatlar sunar 4,8.
AAV için daha düşük bir doz gerekirken. PHP.eB (tipik olarak 1 ila 5 x 1011 Genom Kopyası (GC)/fare) AAV9 (4 x 1012 GC/fare)7 ile karşılaştırıldığında, doğrudan enjeksiyon stratejilerine (tipik olarak 1 x 109 GC/μL enjeksiyon) kıyasla daha fazla vektör üretilmesi gerekir. Çoğu doğal serotip, iyodiksanol saflaştırması 9,10,11,12 ile kombinasyon halinde klasik yapışık hücre kültürü sistemi kullanılarak üretilebilir. AAV için. PHP.eB bu, bir deney8 için yeterli vektörleri elde etmek için hücreleri kültürlemek ve transfekte etmek için emek yoğun bir süreç gerektirir. Bu nedenle, konik tüplerde süspansiyon hücre kültüründe AAV üretimi geliştirilmiştir. 300 mL'ye kadar kapasiteye sahip konik borular kompakttır ve hem inkübatör alanından hem de plastikten tasarruf sağlar. Süspansiyon hücrelerinin kültürlenmesi ve büyük miktarlarda işlenmesi, 15 cm'lik plakalar üzerindeki yapışık hücrelere göre çok daha kolaydır. Protokolün transfeksiyon bileşenleri aynı kalır. Bu nedenle, daha önce yapışık sistemle kullanılan plazmitler, süspansiyon hücrelerinde üretime dayalı olarak bu protokolde rahatlıkla kullanılabilir. Protokol, laboratuvardaki diğer araştırmacılara başarıyla aktarıldı ve çeşitli kapsidler ve yapılar için başarıyla kullanıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5920701002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>587633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5820747005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5948000315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 600 ml cell culture tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>66129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Minitron 50 mm</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>500043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-MAX Production Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3583401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Tray Universal</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep - Iodixanol</td>
			<td>Serumwerk bernburg</td>
			<td>1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-VirusGEN</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mir 6706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-50ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-600ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Production Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28932363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-yield adeno associated vector batches using hek293 suspension cells

Adeno ilişkili viral vektörler (AAV'ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS'nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV'ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 1012 genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 1012 GC ve TransIt toplamda 2.4 x 1013 GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.

Adeno-associated virus (AAV) was discovered in 1965 and has since been used in a myriad of applications1. AAVs have been applied in neuroscience research to study gene and neuronal function, map neurocircuits, or produce animal models for disease2. Traditionally, this is done by injecting directly at the site of interest, as most natural serotypes do not cross the blood-brain barrier or need a high dose to do so1,2,3.
With the discovery of AAV.PHP.B4 and next-generation capsids such as AAV.PHP.eB5 and AAV.CAP-B106, it is possible to target the central nervous system (CNS) using a simple systemic injection. Spatial mapping reveals the cells targeted by AAV.PHP.eB at cellular level6,7. In combination with specific promoters/enhancers, these capsids offer extensive opportunities for neuroscientists to study genes and brain function by non-invasive AAV delivery4,8.
While a lower dose is needed for AAV.PHP.eB (typically 1 to 5 x 1011 Genome Copies (GC)/mouse) compared to AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7, still more vector needs to be produced compared to direct injection strategies (typically 1 x 109 GC/&#181;L injection). Most natural serotypes can be produced using the classical adherent cell culture system in combination with iodixanol purification9,10,11,12. For AAV.PHP.eB this entails a labor-intensive process to culture and transfect cells to obtain sufficient vectors for one experiment8. Therefore, the production of AAV in suspension cell culture in conical tubes was developed. Conical tubes, with a capacity of up to 300 mL, are compact, saving both incubator space and plastics. Suspension cells are much easier to culture and handle in large amounts than adherent cells on 15 cm plates. The transfection components of the protocol remain the same. Therefore, plasmids previously used with the adherent system can easily be used in this protocol based on production in suspension cells. The protocol was successfully transferred to other researchers in the laboratory and successfully used for various capsids and constructs.

Yazar Spotlight: HEK293 Süspansiyon Hücresi Yetiştiriciliği Yoluyla Yüksek Verimli AAV Vektörleri ile Gen Terapisini Geliştirme

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Çoğu akademik laboratuvar, AAV üretimi için yapışık HEK293T hücreleri kullanır 8,9. Bu, doğrudan enjeksiyon için küçük miktarlarda AAV gerektiğinde nispeten iyi çalışsa da, AAV gibi sistemik kapsidlerle benzer transdüksiyon elde etmek için 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 GC / fare) gereklidir. PHP.eB (İngilizce).
Bu protokolde, konik tüplerde kültüre edilen süspansiyon HEK293 hücrel...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy with High-Yield AAV Vectors Through HEK293 Suspension Cell Cultivation at JoVE.com

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Laboratuvarımız, terapötik genleri yaralı sinir sistemine iletmek için bir platform olarak viral vektörleri kullanır. Son zamanlarda, kan-beyin bariyerini geçebilen çok sayıda non-invaziv viral vektör geliştirilmiştir. Bu vektörlerin kullanımı, yüksek titreler ve dolayısıyla gelişmiş bir üretim süreci gerektirir.HEK293 Süspansiyon Hücresi Prosedürümüzün uygulanması, bu AAV protokolünü diğer yapışık hücre tabanlı sistemlere kıyasla daha az zahmetli hale getirirken, aynı zamanda AV vektörlerinden daha yüksek verim elde eder. Merkezi sinir sistemindeki hasarı onarmak için herhangi bir tedavi yoktur. Merkezi sinir sistemi onarımını uyarmak için non-invaziv viral vektörler kullanmayı amaçlıyoruz.Bu protokolün avantajı, artık viral vektörleri yüksek verimle üretebilmemizdir, bu da yaralı merkezi sinir sistemine non-invaziv terapötik gen iletimi gerçekleştirmemize izin verir. Mevcut çalışmamız, multipl skleroz, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi çoklu nörodejeneratif hastalıklar için non-invaziv gen terapisi geliştirmenin yolunu açacaktır.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

1.6K Görüntüleme.  Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW). Laboratuvarımız, terapötik genleri yaralı sinir sistemine iletmek için bir platform olarak viral vektörleri kullanır. Son zamanlarda, kan-beyin bariyerini geçebilen çok sayıda non-invaziv viral vektör geliştirilmiştir. Bu vektörlerin kullanımı, yüksek titreler ve dolayısıyla gelişmiş bir üretim süreci gerektirir.HEK293 Süspansiyon Hücresi Prosedürümüzün uygulanması, bu AAV protokolünü diğer yapışık hücre tabanlı sistemlere kıyasla daha az zahmetli...

Video: Yazar Spotlight: HEK293 Süspansiyon Hücresi Yetiştiriciliği Yoluyla Yüksek Verimli AAV Vektörleri ile Gen Terapisini Geliştirme

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.