Este trabajo contó con el apoyo de una beca del fondo de investigación de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y una subvención de Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sus aportes y consejos en la configuración del protocolo. Las figuras fueron creadas con Biorender.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Real Academia de Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y se ajustaron a la Ley holandesa de experimentación animal en el marco del proyecto número AVD8010020199126. En la Figura 1, se proporciona una descripción general esquemática del protocolo completo. Desde la siembra de células hasta la purificación de AAV, el protocolo tarda 6 días en completarse.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Purificación de plásmidos<ol><li>Realice la extracción de plásmidos como lo describe el fabricante con algunos ajustes para garantizar la esterilidad de los plásmidos.</li>
		<li>Prepare etanol al 70% con agua destilada estéril y etanol absoluto.</li>
		<li>Después de la etapa de centrifugación de isopropanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y agregue etanol estéril al 70% a los tubos. Después de la precipitación de etanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y vuelva a suspender el plásmido en agua destilada estéril. Tenga cuidado de utilizar tubos de microcentrífuga esterilizados.</li>
		<li>Tome una alícuota para la cuantificación, el análisis de restricción y, si es necesario, la secuenciación. Se recomienda comprobar la integridad de las repeticiones terminales invertidas (ITR), ya que las mutaciones pueden tener un impacto negativo en el rendimiento. Ajuste la concentración de la muestra a 1 μg/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de 10x Tampón de lisis Tween<ol><li>Disuelva 30,3 g de tampón Tris y 2,033 g de MgCl2,6H 2O en 400 ml de agua destilada estéril, ajuste el pH a 8,0 y aumente el volumen total a 450 ml.</li>
		<li>Mantenga el Tween 20 estéril, agregue 50 ml de Tween 20 a la solución tampón en la campana y esterilice con un filtro de vacío de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluciones de yodixanol<ol><li>La solución de yodixanol se suministra a una concentración del 60%. Utilice la solución inicial para hacer soluciones de 15%, 25% y 40%.</li>
		<li>Para una solución al 15 %, diluir 60 ml de solución al 60 % con 48 ml de NaCl 5 M y 48 ml de PBS-MK (5 veces PBS con 5 mM de MgCl2 y 12,5 mM de KCl) y agregar agua destilada hasta 240 ml.</li>
		<li>Para una solución al 25%, diluir 67 ml de solución al 60% y 32 ml de PBS-MK. Agregue agua destilada hasta 160 ml. Mezclar bien y añadir 1,6 ml de solución de rojo de fenol.</li>
		<li>Para una solución al 40 %, diluya 160 ml de solución al 60 % con 48 ml de PBS-MK y agregue agua destilada hasta 240 ml. Para una solución al 60%, agregue 1 ml de rojo de fenol a 100 ml de solución al 60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de sacarosa PBS al 5%<ol><li>Añadir 25 g de sacarosa a un frasco de 500 ml de DPBS sin calcio ni magnesio. Agitar bien y filtrar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de polietilenglicol (PEG) 8000<ol><li>Disolver 400 g de PEG 8000 y 24 g de NaCl en agua destilada estéril y ajustar a un volumen final de 1000 mL. Revuelva con fuego hasta que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 7.4 usando papel de pH.</li>
		<li>Esterilizar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM para obtener una solución PEG 8000 al 40%. Tenga en cuenta que la filtración tardará un tiempo debido a la viscosidad del almacén de solución a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivo de células en suspensión HEK293
<ol><li>Use toallitas empapadas en etanol al 70% para la limpieza. Limpie la campana de bioseguridad, prepare y limpie todos los materiales necesarios para el cultivo de células.</li>
	<li>Precalentar 30 mL de medio celular de suspensión a 37 °C en un tubo de cultivo cónico de 50 mL. Recuperar células de producción viral a partir de nitrógeno líquido. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Justo antes de que el vial se descongele por completo, límpielo con una toallita empapada en etanol al 70% y transfiera el vial a la campana de bioseguridad. NOTA: Los detalles de las células de producción viral utilizadas aquí se proporcionan en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Transfiera rápidamente las células al tubo de cultivo cónico precalentado de 50 ml. Cultivo de células en incubadora de agitación a 37 °C, 80% de humedad, 8% de CO2, 200 revoluciones por minuto (RPM) y un diámetro de agitación de 50 mm. Células de paso, una vez que la viabilidad es superior al 90% y la densidad celular es superior a 1-3 x 106 células/mL. NOTA: La incubadora utilizada tiene un diámetro de agitación de 50 mm; Las condiciones de cultivo deben ajustarse para un diámetro de agitación diferente.</li>
	<li>Pasar las células 3-4 días después de la descongelación. Revise los tubos de cultivo para asegurarse de que no haya signos de contaminación; Por ejemplo, el hongo aparecerá como un anillo descolorido (negro o verde).</li>
	<li>Preparar 400 μL de solución de azul de tripano al 0,4% por muestra utilizando una tira de 1 mL.</li>
	<li>Recupere rápidamente las células en suspensión de la incubadora. Extraiga inmediatamente 500 μL del tubo con una tira de 1 mL. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Añadir 100 μL de suspensión celular al tubo de azul de tripano preparado. Invierta suavemente el tubo para mezclar; No pipetear para mezclar, ya que esto provocará la muerte celular. Regrese las células a la incubadora.</li>
	<li>Tome 50 μL de suspensión celular tratada con azul de tripano y aplíquelo al portaobjetos del hemocitómetro. Cuente el total de células viables y calcule la cantidad de suspensión celular y el medio necesario para el paso o la transfección al día siguiente.</li>
	<li>Calentar el medio en la incubadora durante 10-15 min. Agregue la suspensión celular al medio calentado y regrese a la incubadora. Para células de paso durante 3 días (es decir, de lunes a jueves), ajuste a 0,5 x 106 células/ml; para las células de paso durante 4 días (es decir, de jueves a lunes), se establece en 0,3 x 106 células/ml. NOTA: Según el fabricante, las células de producción viral se duplican cada 26 h y deben estar entre 3,5 x 106 y 5,5 x 106 antes de pasar al paso. Las celdas se pueden conservar hasta el paso 20.</li>
</ol>3. Transfección
<ol><li>Día 1<ol><li>A las 24 h antes de la transfección, cultivar 1 x 106 células por/mL en 300 mL de medio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Medio caliente, plásmidos y reactivo de transfección a temperatura ambiente. Para conocer las cantidades a preparar, consulte la Tabla 1.</li>
		<li>Brevemente plásmidos y reactivos de vórtice. Agregue plásmidos al medio preparado, vórtice. Agregue brevemente el reactivo de transfección y el vórtice. No agite la mezcla después de este paso. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Mientras tanto, cuente las células preparadas el día 1. Las células deben estar entre 2 y 2,5 x 106 células por ml y > 95% viables.</li>
		<li>Después de la incubación, gota a gota, agregue la mezcla de transfección a las células mientras gira suavemente el tubo. Incubar durante 72-96 h.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recolección de las células
<ol><li>Día 5<ol><li>Añadir 33 mL de tampón de lisis celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), mezclar agitando suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h con agitación.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar a través de un filtro de vacío PES de 0,45 μM para clarificar el lisado celular, dejando el lisado clarificado en el recipiente del filtro. NOTA: Opcional después de la filtración: tomar 50 μL de muestra para PCR cuantitativa (Q-PCR).</li>
		<li>Añadir 90 ml de solución PEG 8000 al 40% a 360 ml de lisado celular filtrado.</li>
		<li>Limpie la barra agitadora con etanol al 70% y agréguela a la muestra. Revuelva en hielo o en la cámara frigorífica a 300 RPM durante 1 h. Incubar a 4 °C sin agitar durante la noche. NOTA: Se han probado tiempos de incubación de 1 h a 72 h. Los tiempos de incubación más largos tienen un efecto negativo en la precipitación general de proteínas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Purificación de yodixanol
<ol><li>Día 6<ol><li>Transfiera toda la muestra de volumen de cultivo precipitado PEG a un tubo cónico grande y limpio y centrífugo a 2820 x g y 4 °C durante 15 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de PEG en 15 mL de DPBS con calcio y magnesio. El gránulo es difícil de resuspender; Tómese el tiempo para hacer esto con cuidado.</li>
		<li>Transfiera la pieza resuspendida a un tubo limpio de 50 ml. El PEG permanecerá a los lados del tubo del biorreactor. Agregue 10 ml adicionales, teniendo cuidado de recoger todo el precipitado de PEG. Transfiera todo a un recipiente de 50 ml para obtener un volumen total de 25-30 ml.</li>
		<li>Añadir 40 μL de DNasa I (10 U/μL). Colocar en la incubadora durante 1 h 37°C. NOTA: Opcional después de la incubación de la DNasa: tomar 50 μL de muestra para Q-PCR.</li>
		<li>Limpie bien las barras de agitación que se utilizaron para la precipitación de PEG con una solución de cloruro seguida de etanol al 70%. Deje las barras agitadoras en etanol al 70% para el próximo experimento.</li>
		<li>Llene un tubo de polialómero de 25 mm x 89 mm con una pipeta Pasteur de vidrio con 15,5 ml de lisado celular concentrado en cada tubo. Después de añadir el lisado celular, cambie la pipeta Pasteur de vidrio por una nueva.</li>
		<li>Añadir soluciones de yodixanol del 15% al 60%: infundir 9 ml de la solución de yodixanol al 15% suavemente debajo del lisado celular. A continuación, agregue 5 ml de las soluciones de yodixanol al 25% y 40% y, por último, agregue 5 ml de la solución de yodixanol al 60%.</li>
		<li>Rellene el tubo con una jeringa con DPBS +/+ para eliminar la mayoría de las burbujas de aire, teniendo cuidado de no alterar las capas de yodixanol. Selle el tubo con un adorno de tubo eléctrico.</li>
		<li>Centrifugar en un rotor no oscilante durante 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C en una ultracentrífuga. Retire de la ultracentrífuga, ensamble los tubos en un broche de metal y prepare los tubos de recolección. Abra el rotor en el capó en caso de derrames durante el centrifugado.</li>
		<li>Prepare un tubo de 50 ml (para desechar el tubo del rotor), un tubo de 15 ml (para recoger el virus), una jeringa de 5 ml y una aguja de 30 G y 19 G por gradiente.</li>
		<li>Perfore un agujero en la parte superior del tubo con una aguja de 30 G. Deje la aguja en su lugar. Coloque una aguja de 19G en la jeringa.</li>
		<li>Perfore con cuidado el tubo justo debajo de la interfaz 40%/60%, que se puede ver por el indicador rojo de fenol. Asegúrese de que el bisel de la aguja esté orientado hacia la capa del 40%.</li>
		<li>Retire la aguja 30G de la parte superior del tubo con la mano no dominante. Con la aguja biselada, extraiga lentamente el virus/yodixanol. El objetivo es extraer entre 3 mL y 4,5 mL. Aproximadamente a la mitad y bien dentro de la capa de 40%/transparente, gire la aguja para que el bisel quede hacia abajo y continúe extrayendo para evitar la recolección de la capa de proteína.</li>
		<li>Prepare el tubo de 50 ml con la mano no dominante, extraiga con cuidado la aguja mientras coloca el tubo en el tubo de 50 ml y deséchelo. Diluya la suspensión de AAV/iodixanol 5 veces en DPBS llenando hasta 15 ml.</li>
		<li>Transferir a un tubo de filtro centrífugo y centrifugar a 3428 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el flujo continuo; Retire con cuidado el soporte del filtro y coloque el recipiente inferior en una botella de desecho. Agregue 15 ml de sacarosa PBS-5% para filtrar y vuelva a suspender.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita el intercambio de búfer al menos 3 veces. Almacenar virus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B un máximo de 3 meses) o alícuotas en alícuotas de 50 μL y almacenar a -80 °C durante mucho tiempo. NOTA: PHP. Las variantes de la cápside B son sensibles a la congelación/descongelación, por lo que esto debe evitarse.</li>
		<li>Realice la valoración como se describe en un protocolo anterior10.</li>
	</ol></li>
</ol>

Producción simplificada y eficiente de AAV con el cultivo en suspensión HEK293

<ol>
	<li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases.">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).</li><li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration.">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood&#8211;brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system.">Several rAAV vectors efficiently cross the blood&#8211;brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li><li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset.">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960 (2019).</li><li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li><li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy,+methods+and+protocols.">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li><li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addgene+AAV+data+hub:+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data.">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li><li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li><li>Blessing, D., D&#233;glon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells,+methods+and+protocols.">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li></ol>

Mirus proporcionó una muestra gratuita de TransIT para las pruebas iniciales, después de lo cual se compró el reactivo para su uso posterior. Los autores no tienen otros intereses financieros contrapuestos que informar.

La administración sistémica de AAV es una herramienta poderosa para la transferencia de genes al SNC; sin embargo, la producción de AAV es un proceso costoso y laborioso. Mediante el uso de celdas de suspensión, se reduce la mano de obra y los plásticos en comparación con el cultivo adherente de HEK293T en placas de 15cm2 . Además, los tubos cónicos implementados aquí son fáciles de manejar y maximizan el uso del espacio del laboratorio. El protocolo fue establecido por dos investigadores y posterior...

El virus adenoasociado (AAV) fue descubierto en 1965 y desde entonces se ha utilizado en una gran cantidadde aplicaciones. Los AAV se han aplicado en la investigación neurocientífica para estudiar la función génica y neuronal, mapear neurocircuitos o producir modelos animales para enfermedades2. Tradicionalmente, esto se hace inyectando directamente en el sitio de interés, ya que la mayoría de los serotipos naturales no atraviesan la barrera hematoencefálica ni necesitan una dosis alta para hacerlo 1,2,3.
Con el descubrimiento de AAV. PHP.B4 y cápsidas de última generación como AAV. PHP.eB5 y AAV. CAP-B106, es posible dirigirse al sistema nervioso central (SNC) mediante una simple inyección sistémica. El mapeo espacial revela las células a las que se dirige AAV. PHP.eB a nivel celular 6,7. En combinación con promotores/potenciadores específicos, estas cápsidas ofrecen amplias oportunidades para que los neurocientíficos estudien los genes y la función cerebral mediante la administración no invasiva de AAV 4,8.
Mientras que se necesita una dosis más baja para AAV. PHP.eB (típicamente 1 a 5 x 1011 copias del genoma (GC)/ratón) en comparación con AAV9 (4 x 1012 GC/ratón)7, aún se necesita producir más vector en comparación con las estrategias de inyección directa (típicamente inyección de 1 x 109 GC/μL). La mayoría de los serotipos naturales se pueden producir utilizando el sistema clásico de cultivo celular adherente en combinación con la purificación de yodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB Esto implica un proceso laborioso de cultivo y transfectación de células para obtener suficientes vectores para un experimento8. Por lo tanto, se desarrolló la producción de AAV en cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los tubos cónicos, con una capacidad de hasta 300 ml, son compactos, lo que ahorra espacio en la incubadora y plásticos. Las células en suspensión son mucho más fáciles de cultivar y manipular en grandes cantidades que las células adherentes en placas de 15 cm. Los componentes de transfección del protocolo siguen siendo los mismos. Por lo tanto, los plásmidos utilizados previamente con el sistema adherente pueden utilizarse fácilmente en este protocolo basado en la producción en células en suspensión. El protocolo se transfirió con éxito a otros investigadores en el laboratorio y se utilizó con éxito para varias cápsidas y construcciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5920701002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>587633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5820747005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5948000315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 600 ml cell culture tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>66129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Minitron 50 mm</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>500043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-MAX Production Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3583401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Tray Universal</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep - Iodixanol</td>
			<td>Serumwerk bernburg</td>
			<td>1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-VirusGEN</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mir 6706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-50ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-600ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Production Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28932363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-yield adeno associated vector batches using hek293 suspension cells

Los vectores virales adenoasociados (AAV) son una herramienta notable para investigar el sistema nervioso central (SNC). Cápsidas innovadoras, como AAV. PHP.eB, demuestran una transducción extensa del SNC por inyección intravenosa en ratones. Para lograr una transducción comparable, se necesita un título 100 veces mayor (mínimo 1 x 1011 copias del genoma por ratón) en comparación con la inyección directa en el parénquima del SNC. En nuestro grupo, la producción de AAV, incluido el AAV. PHP.eB se basa en células HEK293T adherentes y en el método de triple transfección. Lograr altos rendimientos de AAV con células adherentes implica un proceso intensivo en mano de obra y materiales. Esta limitación impulsó el desarrollo de un protocolo para el cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los AAV generados en las células adherentes se compararon con el método de producción en suspensión. Se compararon cultivos en suspensión utilizando reactivos de transfección Polietilenimina o TransIt. Los vectores AAV se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol, seguida de intercambio de tampón y concentración mediante un filtro centrífugo. Con el método adherente, logramos un promedio de 2.6 x10 12 copias del genoma (GC) en total, mientras que el método de suspensión y la polietilenimina produjeron 7.7 x 1012 GC en total, y TransIt produjo 2.4 x 1013 GC en total. No hay diferencia en la eficiencia de transducción in vivo entre los vectores producidos con adherente en comparación con el sistema de celdas de suspensión. En resumen, se introduce un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que da como resultado una menor cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para la producción de vectores, al tiempo que se logran rendimientos de 3 a 9 veces mayores utilizando componentes disponibles de proveedores comerciales con fines de investigación.

Adeno-associated virus (AAV) was discovered in 1965 and has since been used in a myriad of applications1. AAVs have been applied in neuroscience research to study gene and neuronal function, map neurocircuits, or produce animal models for disease2. Traditionally, this is done by injecting directly at the site of interest, as most natural serotypes do not cross the blood-brain barrier or need a high dose to do so1,2,3.
With the discovery of AAV.PHP.B4 and next-generation capsids such as AAV.PHP.eB5 and AAV.CAP-B106, it is possible to target the central nervous system (CNS) using a simple systemic injection. Spatial mapping reveals the cells targeted by AAV.PHP.eB at cellular level6,7. In combination with specific promoters/enhancers, these capsids offer extensive opportunities for neuroscientists to study genes and brain function by non-invasive AAV delivery4,8.
While a lower dose is needed for AAV.PHP.eB (typically 1 to 5 x 1011 Genome Copies (GC)/mouse) compared to AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7, still more vector needs to be produced compared to direct injection strategies (typically 1 x 109 GC/&#181;L injection). Most natural serotypes can be produced using the classical adherent cell culture system in combination with iodixanol purification9,10,11,12. For AAV.PHP.eB this entails a labor-intensive process to culture and transfect cells to obtain sufficient vectors for one experiment8. Therefore, the production of AAV in suspension cell culture in conical tubes was developed. Conical tubes, with a capacity of up to 300 mL, are compact, saving both incubator space and plastics. Suspension cells are much easier to culture and handle in large amounts than adherent cells on 15 cm plates. The transfection components of the protocol remain the same. Therefore, plasmids previously used with the adherent system can easily be used in this protocol based on production in suspension cells. The protocol was successfully transferred to other researchers in the laboratory and successfully used for various capsids and constructs.

Autor destacado: Avance de la terapia génica con vectores AAV de alto rendimiento a través del cultivo de células en suspensión HEK293

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Our lab uses viral vectors as a platform to deliver therapeutic genes to the injured nervous system. Recently, numerous non-invasive viral vectors which are able to cross the blood-brain barrier have been developed. Use of these vectors requires high titers and therefore an improved production process.The implementation of our HEK293 Suspension Cell Procedure makes this AAV protocol less laborious compared to other adherent cell based systems, while at the same time gaining higher yields of AV vectors. There are no treatments to repair the damage in the central nervous system. We aim to use non-invasive viral vectors to stimulate central nervous system repair.The advantage of this protocol is that we can now produce viral vectors at high yield, which allows us to perform non-invasive therapeutic gene delivery to the injured central nervous system. Our current work will pave the way to develop non-invasive gene therapy for multiple neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis, Parkinson's and Alzheimer's disease.

La mayoría de los laboratorios académicos utilizan células HEK293T adherentes para la producción de AAV 8,9. Si bien esto funciona relativamente bien cuando se necesitan pequeñas cantidades de AAV para la inyección directa, se necesita un título 100 veces más alto (mínimo 1 x 1011 GC/ratón) para lograr una transducción similar con cápsidas sistémicas como AAV. PHP.eB.
En este protocolo se estableció la producci...

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Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Nuestro laboratorio utiliza vectores virales como plataforma para administrar genes terapéuticos al sistema nervioso lesionado. Recientemente, se han desarrollado numerosos vectores virales no invasivos que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. El uso de estos vectores requiere títulos altos y, por lo tanto, un proceso de producción mejorado.La implementación de nuestro procedimiento de células de suspensión HEK293 hace que este protocolo AAV sea menos laborioso en comparación con otros sistemas basados en células adherentes, mientras que al mismo tiempo obtiene mayores rendimientos de vectores AV. No existen tratamientos para reparar el daño en el sistema nervioso central. Nuestro objetivo es utilizar vectores virales no invasivos para estimular la reparación del sistema nervioso central.La ventaja de este protocolo es que ahora podemos producir vectores virales con un alto rendimiento, lo que nos permite realizar una entrega terapéutica no invasiva de genes al sistema nervioso central lesionado. Nuestro trabajo actual allanará el camino para desarrollar una terapia génica no invasiva para múltiples enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple, el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

1.4K vistas.  Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW). Nuestro laboratorio utiliza vectores virales como plataforma para administrar genes terapéuticos al sistema nervioso lesionado. Recientemente, se han desarrollado numerosos vectores virales no invasivos que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. El uso de estos vectores requiere títulos altos y, por lo tanto, un proceso de producción mejorado.La implementación de nuestro procedimiento de células de suspensión HEK293 hace que este protocolo AAV sea menos laborioso ...

Video: Autor destacado: Avance de la terapia génica con vectores AAV de alto rendimiento a través del cultivo de células en suspensión HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.