Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do fundo de pesquisa da Academia Real de Artes e Ciências dos Países Baixos (KNAW) e uma bolsa da Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sua contribuição e conselhos na configuração do protocolo. As figuras foram criadas usando Biorender.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Royal Netherlands Academy of Sciences (KNAW) e estavam de acordo com a Lei Holandesa de Experimentação Animal sob o projeto número AVD8010020199126. Na Figura 1, uma visão geral esquemática do protocolo completo é fornecida. Da semeadura das células à purificação do AAV, o protocolo leva 6 dias para ser concluído.
1. Preparação dos reagentes
<ol><li>Purificação de plasmídeos<ol><li>Realizar extração de plasmídios conforme descrito pelo fabricante com alguns ajustes para garantir a esterilidade dos plasmídeos.</li>
		<li>Preparar etanol 70% usando água destilada estéril e etanol absoluto.</li>
		<li>Após a etapa de centrifugação do isopropanol, seque os plasmídeos na capela de fluxo e adicione etanol 70% estéril aos tubos. Após a precipitação do etanol, secar os plasmídeos na capela de fluxo e ressuspender o plasmídeo em água destilada estéril. Tome cuidado ao usar tubos de microcentrífuga esterilizados.</li>
		<li>Pegue uma alíquota para quantificação, análise de restrição e, se necessário, sequenciamento. É aconselhável verificar a integridade das repetições terminais invertidas (ITRs), pois as mutações podem ter um impacto negativo no rendimento. Ajustar a concentração da amostra para 1 μg/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de tampão de lise Tween 10x<ol><li>Dissolver 30,3 g de tampão Tris e 2,033 g MgCl2,6H 2O em 400 mL de água destilada estéril, ajustar o pH para 8,0 e aumentar o volume total para 450 mL.</li>
		<li>Manter Tween 20 estéril, adicionar 50 mL de Tween 20 à solução tampão no exaustor e filtrar esterilizar usando um filtro a vácuo de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluições de iodicxanol<ol><li>A solução de iodixanol é fornecida na concentração de 60%. Use a solução inicial para fazer soluções de 15%, 25% e 40%.</li>
		<li>Para solução a 15%, diluir 60 mL de solução a 60% com 48 mL de NaCl 5 M e 48 mL de PBS-MK (5x PBS com 5 mM MgCl2 e 12,5 mM KCl) e adicionar água destilada até 240 mL.</li>
		<li>Para solução a 25%, diluir 67 ml de solução a 60% e 32 ml de PBS-MK. Adicionar água destilada até 160 mL. Misture bem e adicione 1,6 mL de solução de vermelho de fenol.</li>
		<li>Para solução a 40%, diluir 160 ml de solução a 60% com 48 ml de PBS-MK e adicionar água destilada até 240 ml. Para a solução a 60%, adicionar 1 ml de vermelho de fenol a 100 ml de solução a 60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de sacarose a 5% PBS<ol><li>Adicionar 25 g de sacarose a um frasco de 500 mL de DPBS sem cálcio ou magnésio. Agite bem e filtre usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de polietilenoglicol (PEG) 8000<ol><li>Dissolver 400 g de PEG 8000 e 24 g de NaCl em água destilada estéril e ajustar para um volume final de 1000 mL. Mexa com o aquecimento até dissolver completamente. Ajuste o pH para 7,4 usando papel pH.</li>
		<li>Esterilizar o filtro usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM para obter uma solução de PEG 8000 a 40%. Observe que a filtração levará um tempo devido à viscosidade do armazenamento da solução a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura de células de suspensão HEK293
<ol><li>Use lenços umedecidos embebidos em etanol 70% para limpeza. Limpar a coifa de biossegurança, preparar e limpar todos os materiais necessários para a cultura das células.</li>
	<li>Pré-aquecer 30 mL de meio de célula de suspensão a 37 °C em um tubo de cultura cônico de 50 mL. Recuperar células de produção viral de nitrogênio líquido. Descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Pouco antes de o frasco para injetáveis ser completamente descongelado, limpe-o com um lenço embebido em etanol a 70% e transfira o frasco para injetáveis para a tampa de biossegurança. NOTA: Os detalhes das células de produção viral usadas aqui são fornecidos na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Transfira rapidamente as células para o tubo de cultura cônico pré-aquecido de 50 mL. Células de cultura em incubadora de agitação a 37 °C, 80% de umidade, 8% de CO2, 200 rotações por min (RPM) e um diâmetro de agitação de 50 mm. Células de passagem, uma vez que a viabilidade está acima de 90% e a densidade celular está acima de 1-3 x 106 células/mL. OBS: A incubadora utilizada possui diâmetro de agitação de 50 mm; As condições de cultura devem ser ajustadas para um diâmetro de agitação diferente.</li>
	<li>Células de passagem 3-4 dias após o descongelamento. Verifique o(s) tubo(s) de cultura para se certificar de que não há sinais de contaminação; Por exemplo, o fungo aparecerá como um anel descolorido (preto ou verde).</li>
	<li>Preparar 400 μL de solução de azul de tripano a 0,4% por amostra utilizando uma stripette de 1 ml.</li>
	<li>Recupere rapidamente as células de suspensão da incubadora. Extrair imediatamente 500 μL do tubo utilizando uma stripette de 1 ml. Pipete suavemente para cima e para baixo.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de suspensão celular ao tubo azul de tripano preparado. Inverta suavemente o tubo para misturar; Não pipetar para misturar, pois isso levará à morte celular. Células de retorno à incubadora.</li>
	<li>Tomar 50 μL de suspensão de células tratadas com azul de tripano e aplicá-lo na lâmina do hemocitômetro. Conte o total de células viáveis e calcule a quantidade de suspensão celular e meio necessário para a passagem ou transfecção no dia seguinte.</li>
	<li>Meio quente na incubadora por 10-15 min. Adicione a suspensão celular ao meio aquecido e retorne à incubadora. Para células de passagem por 3 dias (ou seja, de segunda a quinta-feira), ajuste para 0,5 x 106 células/mL; para células de passagem por 4 dias (ou seja, de quinta-feira a segunda-feira), definido como 0,3 x 106 células/mL. NOTA: De acordo com o fabricante, as células de produção viral dobram a cada 26 h e devem estar entre 3,5 x 106 e 5,5 x 106 antes da passagem. As celas podem ser mantidas por até a passagem 20.</li>
</ol>3. Transfecção
<ol><li>Dia 1<ol><li>T24 h antes da transfecção, cultura 1 x 106 células por mL em 300 mL de meio.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Meio quente, plasmídeos e reagente de transfecção à temperatura ambiente. Para os montantes a preparar, ver Quadro 1.</li>
		<li>Brevemente plasmídeos de vórtice e reagentes. Adicione plasmídeos ao meio preparado, vórtice. Adicione o reagente de transfecção e o vórtice brevemente. Não agite a mistura após esta etapa. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Enquanto isso, conte as células preparadas no dia 1. As células devem estar entre 2 e 2,5 x 106 células por mL e > 95% viáveis.</li>
		<li>Após a incubação, gota a gota, adicione a mistura de transfecção às células enquanto gira suavemente o tubo. Incubar por 72-96 h.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Colheita das células
<ol><li>Dia 5<ol><li>Adicionar 33 ml de tampão de lise celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), agitar suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h com agitação.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar através de um filtro a vácuo de PES 0,45 μM para clarificar o lisado celular, deixando o lisado clarificado no recipiente do filtro. NOTA: Opcional após a filtração: colher 50 μL de amostra para PCR quantitativo (Q-PCR).</li>
		<li>Adicionar 90 mL de solução de PEG 8000 a 40% a 360 mL de lisado celular filtrado.</li>
		<li>Limpe a barra de agitação com etanol 70% e adicione à amostra. Mexa no gelo ou na câmara fria a 300 RPM por 1 h. Incubar a 4 °C sem mexer durante a noite. NOTA: Foram testados tempos de incubação de 1 h a 72 h. Tempos de incubação mais longos têm um efeito negativo sobre a precipitação global de proteínas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Purificação de iodicanol
<ol><li>Dia 6<ol><li>Transfira toda a amostra de volume de cultura precipitada de PEG para um tubo cônico grande e limpo e centrífuga a 2820 x g e 4°C por 15 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de PEG em 15 mL de DPBS com cálcio e magnésio. O pellet é difícil de ressuspender; Tire um tempo para fazer isso com cuidado.</li>
		<li>Transfira a peça ressuspensa para um tubo limpo de 50 mL. O PEG permanecerá nas laterais do tubo do biorreator. Adicione mais 10 mL, tomando o cuidado de reunir todo o precipitado de PEG. Transfira tudo para um recipiente de 50 mL para um volume total de 25-30 mL.</li>
		<li>Adicionar 40 μL de DNaseI (10 U/μL). Colocar na incubadora por 1 h 37°C. NOTA: Opcional após a incubação da DNase: tomar 50 μL de amostra para Q-PCR.</li>
		<li>Barras de agitação limpas que foram usadas para precipitação de PEG bem com solução de cloreto seguida de etanol 70%. Deixe as barras de agitação em etanol 70% para o próximo experimento.</li>
		<li>Preencher um tubo de polialômero de 25 mm x 89 mm usando uma pipeta de vidro Pasteur com 15,5 mL de lisado celular concentrado em cada tubo. Depois de adicionar o lisado celular, troque a pipeta de vidro Pasteur por uma nova.</li>
		<li>Adicionar soluções de iodixanol a 15%-60%: infundir suavemente 9 ml da solução de iodixanol a 15% sob o lisado celular. Em seguida, adicionar 5 mL das soluções de iodixanol a 25% e 40% e, por último, adicionar 5 mL da solução de iodixanol a 60%.</li>
		<li>Tampe o tubo usando uma seringa com DPBS +/+ para remover a maioria das bolhas de ar, tomando cuidado para não perturbar as camadas de iodixanol. Sele o tubo usando um topper de tubo elétrico.</li>
		<li>Centrifugar em rotor não oscilante por 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C em uma ultracentrífuga. Retire da ultracentrífuga, monte os tubos em um fecho metálico e prepare os tubos de coleta. Abra o rotor no capô em caso de derramamentos durante a fiação.</li>
		<li>Preparar um tubo de 50 mL (para descartar o tubo rotor), um tubo de 15 mL (para coletar vírus), uma seringa de 5 mL e uma agulha de 30G e 19G por gradiente.</li>
		<li>Puncione um orifício na parte superior do tubo com uma agulha de 30G. Deixe a agulha no lugar. Coloque uma agulha 19G na seringa.</li>
		<li>Puncione cuidadosamente o tubo logo abaixo da interface de 40%/60%, que pode ser vista pelo indicador vermelho de fenol. Certifique-se de que o bisel da agulha está voltado para a camada de 40%.</li>
		<li>Retire a agulha 30G da parte superior do tubo usando a mão não dominante. Com a agulha chanfrada, extraia lentamente o vírus/iodixanol. O objetivo é extrair entre 3 mL e 4,5 mL. Cerca da metade do caminho e bem na camada de 40%/transparente, gire a agulha para que o bisel fique virado para baixo e continue a extrair para evitar a coleta da camada de proteína.</li>
		<li>Preparar o tubo de 50 mL com a mão não dominante, extrair cuidadosamente a agulha enquanto coloca o tubo no tubo de 50 mL e descartar. Diluir a suspensão de AAV/iodixanol 5x em DPBS enchendo até 15 mL.</li>
		<li>Transfira para um tubo de filtro centrífugo e centrífuga a 3428 x g, 4 °C por 10 min. Escoamento de descarte; Remova suavemente o suporte do filtro e coloque o recipiente inferior em uma garrafa de resíduos. Adicionar 15 mL de sacarose PBS-5% para filtrar e ressuspender.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita a troca de buffer pelo menos 3x. Armazenar vírus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B variantes no máximo 3 meses) ou alíquota em alíquotas de 50 μL e armazenar a -80 °C a longo prazo. NOTA: PHP. As variantes do capsídeo B são sensíveis ao congelamento/descongelamento, por isso isso deve ser evitado.</li>
		<li>Realizar titulação conforme descrito em protocolo anterior10.</li>
	</ol></li>
</ol>

Produção simplificada e eficiente de AAV usando a cultura de suspensão HEK293

<ol>
	<li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases.">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).</li><li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration.">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood&#8211;brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system.">Several rAAV vectors efficiently cross the blood&#8211;brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li><li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset.">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960 (2019).</li><li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li><li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy,+methods+and+protocols.">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li><li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addgene+AAV+data+hub:+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data.">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li><li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li><li>Blessing, D., D&#233;glon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells,+methods+and+protocols.">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li></ol>

Uma amostra gratuita de TransIT foi fornecida pela Mirus para testes iniciais, após os quais o reagente foi comprado para uso posterior. Os autores não têm outros interesses financeiros concorrentes a relatar.

A administração sistêmica de AAV é uma poderosa ferramenta para a transferência gênica para o SNC; no entanto, a produção de AAV é um processo caro e trabalhoso. Com o uso de células de suspensão, a mão de obra e os plásticos são reduzidos em comparação com a cultura aderente de HEK293T em placas de 15cm2 . Além disso, os tubos cônicos implementados aqui são fáceis de manusear e maximizam o uso do espaço do laboratório. O protocolo foi montado por dois pesquisadores e, posteriormente, apl...

O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965 e, desde então, tem sido usado em uma infinidade deaplicações1. Os AAVs têm sido aplicados em pesquisas em neurociência para estudar genes e funções neuronais, mapear neurocircuitos ou produzir modelos animais para doenças2. Tradicionalmente, isso é feito injetando-se diretamente no local de interesse, pois a maioria dos sorotipos naturais não atravessa a barreira hematoencefálica ou necessita de uma dose alta para fazê-lo 1,2,3.
Com a descoberta da AAV. PHP.B4 e capsídeos de próxima geração, como AAV. PHP.eB5 e AAV. CAP-B106, é possível atingir o sistema nervoso central (SNC) com uma simples injeção sistêmica. O mapeamento espacial revela as células alvo do AAV. PHP.eB a nível celular 6,7. Em combinação com promotores/potencializadores específicos, esses capsídeos oferecem amplas oportunidades para neurocientistas estudarem genes e função cerebral por meio da liberação não invasiva de AAV 4,8.
Enquanto uma dose mais baixa é necessária para AAV. PHP.eB (tipicamente 1 a 5 x 1011 Cópias do Genoma (GC)/rato) em comparação com AAV9 (4 x10 12 GC/rato)7, ainda é necessário produzir mais vetor em comparação com as estratégias de injeção direta (tipicamente 1 x 109 GC/μL injecção). A maioria dos sorotipos naturais pode ser produzida utilizando o sistema clássico de cultura celular aderente em combinação com a purificação do iodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB isso implica um processo trabalhoso para cultivar e transfectar células para obter vetores suficientes para um experimento8. Portanto, desenvolveu-se a produção de AAV em cultura de células de suspensão em tubos cônicos. Os tubos cônicos, com capacidade de até 300 mL, são compactos, economizando espaço na incubadora e plásticos. As células de suspensão são muito mais fáceis de cultivar e manusear em grandes quantidades do que as células aderentes em placas de 15 cm. Os componentes de transfecção do protocolo permanecem os mesmos. Portanto, plasmídeos previamente utilizados com o sistema aderente podem ser facilmente utilizados neste protocolo baseado na produção em células de suspensão. O protocolo foi transferido com sucesso para outros pesquisadores no laboratório e usado com sucesso para vários capsídeos e construtos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5920701002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>587633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5820747005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5948000315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 600 ml cell culture tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>66129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Minitron 50 mm</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>500043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-MAX Production Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3583401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Tray Universal</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep - Iodixanol</td>
			<td>Serumwerk bernburg</td>
			<td>1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-VirusGEN</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mir 6706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-50ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-600ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Production Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28932363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-yield adeno associated vector batches using hek293 suspension cells

Os vetores virais adenoassociados (AAVs) são uma ferramenta notável para a investigação do sistema nervoso central (SNC). Capsídeos inovadores, como o AAV. PHP.eB, demonstram extensa transdução do SNC por injeção intravenosa em camundongos. Para obter transdução comparável, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x10 11 cópias do genoma/camundongo) é necessário em comparação com a injeção direta no parênquima do SNC. Em nosso grupo, a produção de AAV, incluindo AAV. O PHP.eB baseia-se em células HEK293T aderentes e no método de tripla transfecção. Alcançar altos rendimentos de AAV com células aderentes envolve um processo trabalhoso e intensivo em material. Essa restrição motivou o desenvolvimento de um protocolo para cultura de células em suspensão em tubos cônicos. Os AAVs gerados em células aderentes foram comparados com o método de produção em suspensão. Foram comparadas culturas em suspensão utilizando os reagentes de transfecção Polietilenimina ou TransIt. Os vetores AAV foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de iodixanol seguido de troca e concentração de tampão com filtro centrífugo. Com o método aderente, obteve-se uma média de 2,6 x 1012 cópias do genoma (CG) no total, enquanto o método de suspensão e Polietilenimina produziram 7,7 x10 12 GC no total, e TransIt produziu 2,4 x 1013 GC no total. Não há diferença na eficiência de transdução in vivo entre vetores produzidos com aderência em relação ao sistema de células de suspensão. Em resumo, um protocolo de produção AAV baseado em células HEK293 de suspensão é introduzido, resultando em uma quantidade reduzida de tempo e mão de obra necessária para a produção de vetores, enquanto alcança rendimentos 3 a 9 vezes maiores usando componentes disponíveis de fornecedores comerciais para fins de pesquisa.

Adeno-associated virus (AAV) was discovered in 1965 and has since been used in a myriad of applications1. AAVs have been applied in neuroscience research to study gene and neuronal function, map neurocircuits, or produce animal models for disease2. Traditionally, this is done by injecting directly at the site of interest, as most natural serotypes do not cross the blood-brain barrier or need a high dose to do so1,2,3.
With the discovery of AAV.PHP.B4 and next-generation capsids such as AAV.PHP.eB5 and AAV.CAP-B106, it is possible to target the central nervous system (CNS) using a simple systemic injection. Spatial mapping reveals the cells targeted by AAV.PHP.eB at cellular level6,7. In combination with specific promoters/enhancers, these capsids offer extensive opportunities for neuroscientists to study genes and brain function by non-invasive AAV delivery4,8.
While a lower dose is needed for AAV.PHP.eB (typically 1 to 5 x 1011 Genome Copies (GC)/mouse) compared to AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7, still more vector needs to be produced compared to direct injection strategies (typically 1 x 109 GC/&#181;L injection). Most natural serotypes can be produced using the classical adherent cell culture system in combination with iodixanol purification9,10,11,12. For AAV.PHP.eB this entails a labor-intensive process to culture and transfect cells to obtain sufficient vectors for one experiment8. Therefore, the production of AAV in suspension cell culture in conical tubes was developed. Conical tubes, with a capacity of up to 300 mL, are compact, saving both incubator space and plastics. Suspension cells are much easier to culture and handle in large amounts than adherent cells on 15 cm plates. The transfection components of the protocol remain the same. Therefore, plasmids previously used with the adherent system can easily be used in this protocol based on production in suspension cells. The protocol was successfully transferred to other researchers in the laboratory and successfully used for various capsids and constructs.

Autor em destaque: Avançando na terapia gênica com vetores AAV de alto rendimento por meio do cultivo de células em suspensão HEK293

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

A maioria dos laboratórios acadêmicos utiliza células HEK293T aderentes para a produção de AAV 8,9. Embora isso funcione relativamente bem quando pequenas quantidades de AAV são necessárias para injeção direta, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x 1011 GC/mouse) é necessário para obter transdução semelhante com capsídeos sistêmicos, como AAV. PHP.eB.
Nesse protocolo, foi estabelecida a produção de AAV...

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Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Nosso laboratório usa vetores virais como uma plataforma para entregar genes terapêuticos ao sistema nervoso lesado. Recentemente, numerosos vetores virais não invasivos que são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica foram desenvolvidos. O uso desses vetores requer altos títulos e, portanto, um processo de produção aprimorado.A implementação do nosso procedimento de célula de suspensão HEK293 torna este protocolo AAV menos trabalhoso em comparação com outros sistemas baseados em células aderentes, ao mesmo tempo em que ganha maiores rendimentos de vetores AV. Não existem tratamentos para reparar os danos no sistema nervoso central. Nosso objetivo é utilizar vetores virais não invasivos para estimular o reparo do sistema nervoso central.A vantagem desse protocolo é que agora podemos produzir vetores virais de alto rendimento, o que nos permite realizar a entrega de genes terapêuticos não invasivos ao sistema nervoso central lesado. Nosso trabalho atual abrirá o caminho para o desenvolvimento de terapia gênica não invasiva para múltiplas doenças neurodegenerativas, como esclerose múltipla, Parkinson e doença de Alzheimer.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

1.6K visualizações.  Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW). Nosso laboratório usa vetores virais como uma plataforma para entregar genes terapêuticos ao sistema nervoso lesado. Recentemente, numerosos vetores virais não invasivos que são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica foram desenvolvidos. O uso desses vetores requer altos títulos e, portanto, um processo de produção aprimorado.A implementação do nosso procedimento de célula de suspensão HEK293 torna este protocolo AAV menos trabalhoso em comparação com outros si...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na terapia gênica com vetores AAV de alto rendimento por meio do cultivo de células em suspensão HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.