עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המחקר של האקדמיה המלכותית ההולנדית לאמנויות ולמדעים (KNAW) ומענק מ-Start2Cure (0-TI-01). אנו מודים ללישה קופ על תרומתה ועצותיה בהגדרת הפרוטוקול. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה המלכותית ההולנדית למדעים (KNAW) והיו בהתאם לחוק ההולנדי לניסויים בבעלי חיים תחת פרויקט מספר AVD8010020199126. באיור 1 מוצגת סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא. מזריעת תאים ועד לטיהור AAV, הפרוטוקול לוקח 6 ימים להשלים.
1. הכנת מגיב
<ol><li>טיהור פלסמיד<ol><li>בצע מיצוי פלסמיד כמתואר על ידי היצרן עם כמה התאמות כדי להבטיח סטריליות של פלסמידים.</li>
		<li>הכינו אתנול 70% באמצעות מים מזוקקים סטריליים ואתנול מוחלט.</li>
		<li>לאחר שלב הצנטריפוגה איזופרופנול, יש לייבש פלסמידים במכסה המנוע של ארון הזרימה ולהוסיף אתנול סטרילי 70% לצינורות. לאחר משקעי אתנול, יבשו את הפלסמידים במכסה המנוע של ארון הזרימה והשעו מחדש את הפלסמיד במים מזוקקים סטריליים. יש להקפיד להשתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות מעוקרים.</li>
		<li>קח aliquot עבור כימות, ניתוח הגבלה, ואם יש צורך, ריצוף. מומלץ לבדוק את תקינות החזרות הטרמינליות ההפוכות (ITR) מכיוון שלמוטציות יכולה להיות השפעה שלילית על התפוקה. התאם את ריכוז הדגימה ל- 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת חיץ ליזיס 10x Tween<ol><li>יש להמיס 30.3 גרם מאגר Tris ו-2.033 גרם MgCl 2.6H 2O ב-400 מ"ל מים מזוקקים סטריליים, להגדיר pH ל-8.0 ולהגדיל את הנפח הכולל ל-450 מ"ל.</li>
		<li>שמור על Tween 20 סטרילי, הוסף 50 מ"ל של Tween 20 לתמיסת חיץ במכסה המנוע, וסנן סטריליזציה באמצעות מסנן ואקום 0.2 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>דילול יודיקסנול<ol><li>תמיסת יודיקסנול מסופקת בריכוז של 60%. השתמש בפתרון ההתחלתי כדי ליצור פתרונות של 15%, 25% ו- 40%.</li>
		<li>עבור תמיסה של 15%, יש לדלל 60 מ"ל של תמיסה של 60% עם 48 מ"ל של 5 M NaCl ו-48 מ"ל של PBS-MK (5x PBS עם 5 mM MgCl2 ו-12.5 mM KCl), ולהוסיף מים מזוקקים עד 240 מ"ל.</li>
		<li>עבור 25% תמיסה, לדלל 67 מ"ל של 60% תמיסה ו 32 מ"ל של PBS-MK. מוסיפים מים מזוקקים עד 160 מ"ל. מערבבים היטב ומוסיפים 1.6 מ"ל של תמיסה אדומה פנול.</li>
		<li>עבור 40% תמיסה, לדלל 160 מ"ל של תמיסה 60% עם 48 מ"ל של PBS-MK ולהוסיף מים מזוקקים עד 240 מ"ל. עבור 60% תמיסה, להוסיף 1 מ"ל של פנול אדום ל 100 מ"ל של 60% תמיסה.</li>
	</ol></li>
	<li>תמיסת PBS 5% סוכרוז<ol><li>הוסף 25 גרם סוכרוז לבקבוק 500 מ"ל של DPBS ללא סידן או מגנזיום. יש לנער היטב ולסנן באמצעות מסנן ואקום של בקבוק 0.2 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>תמיסת פוליאתילן גליקול (PEG) 8000<ol><li>יש להמיס 400 גרם PEG 8000 ו-24 גרם NaCl במים מזוקקים סטריליים ולהתאים לנפח הסופי של 1000 מ"ל. מערבבים עם חימום עד להמסה מלאה. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות נייר pH.</li>
		<li>יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן ואקום של בקבוק 0.2 מיקרומטר לקבלת תמיסת 40% PEG 8000. שים לב כי סינון ייקח זמן מה בשל צמיגות של פתרון לאחסן ב 4 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. תרבית תאי השעיה HEK293
<ol><li>השתמשו במגבונים ספוגים באתנול 70% לניקוי. נקו את מכסה המנוע לבטיחות ביולוגית, הכינו ונקו את כל החומרים הדרושים לגידול תאים.</li>
	<li>מחממים מראש 30 מ"ל של תא השעיה בינוני עד 37 מעלות צלזיוס בצינור תרבית חרוטי 50 מ"ל. אחזור תאי ייצור נגיפיים מחנקן נוזלי. הפשיר במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. רגע לפני שהבקבוקון מופשר לחלוטין, נקו אותו עם מגבון ספוג באתנול 70% והעבירו את הבקבוקון למכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית. הערה: הפרטים של תאי הייצור הנגיפיים המשמשים כאן מופיעים בטבלת החומרים.</li>
	<li>להעביר במהירות תאים לצינור תרבית חרוטי 50 מ"ל שחומם מראש. תאי תרבית באינקובטור רעד בטמפרטורה של 37°C, 80% לחות, 8%CO2, 200 סיבובים לדקה (RPM) וקוטר טלטול של 50 מ"מ. תאי מעבר, פעם אחת הכדאיות היא מעל 90% וצפיפות התאים היא מעל 1-3 x 106 תאים / מ"ל. הערה: האינקובטור המשמש הוא בעל קוטר רעד של 50 מ"מ; יש להתאים את תנאי התרבית לקוטר רעד שונה.</li>
	<li>תאי מעבר 3-4 ימים לאחר ההפשרה. בדוק צינור(ות) תרבית כדי לוודא שאין סימנים של זיהום; לדוגמה, פטרייה תופיע כטבעת דהויה (שחורה או ירוקה).</li>
	<li>הכינו 400 מיקרוליטר של 0.4% תמיסה כחולה טריפאן לכל דגימה באמצעות פס 1 מ"ל.</li>
	<li>שלפו במהירות תאי השעיה מהאינקובטור. מיד לחלץ 500 μL מן הצינור באמצעות פס 1 מ"ל. מזלפים בעדינות למעלה ולמטה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של תרחיף התא לצינור הכחול טריפאן מוכן. הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב; אין לערבב בצנרת, מכיוון שהדבר יוביל למוות תאי. להחזיר תאים לאינקובטור.</li>
	<li>קח 50 μL של תרחיף תאים כחול טריפאן ולהחיל אותו על שקופית hemocytometer. ספור את סך התאים בני קיימא וחשב את כמות תרחיף התאים והמדיום הדרושים למעבר או להעברה למחרת.</li>
	<li>חם בינוני באינקובטור במשך 10-15 דקות. מוסיפים את תרחיף התאים למדיום המחומם וחוזרים לאינקובטור. עבור תאים עוברים במשך 3 ימים (כלומר, שני עד חמישי), להגדיר 0.5 x 106 תאים / מ"ל; עבור תאים עוברים במשך 4 ימים (כלומר, חמישי-שני), מוגדר 0.3 x 106 תאים / מ"ל. הערה: לדברי היצרן, תאי ייצור נגיפיים מכפילים את עצמם כל 26 שעות וצריכים להיות בין 3.5 x 106 ו 5.5 x 106 לפני המעבר. ניתן לשמור תאים עד מעבר 20.</li>
</ol>3. טרנספקציה
<ol><li>יום 1<ol><li>ב 24 שעות לפני transfection, תרבית 1 x 106 תאים לכל / מ"ל ב 300 מ"ל של מדיה.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>מדיום חם, פלסמידים, מגיב transfection לטמפרטורת החדר. לסכומים שיש להכין, ראו טבלה 1.</li>
		<li>בקצרה פלסמידים מערבולת ריאגנטים. מוסיפים פלסמידים למדיום המוכן, מערבולת. מוסיפים מגיב טרנספקציה ומערבולת בקצרה. אין להתסיס את התערובת לאחר שלב זה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
		<li>בינתיים, ספרו תאים שהוכנו ביום הראשון. תאים צריכים להיות בין 2 ל 2.5 x 106 תאים לכל מ"ל ו > 95% קיימא.</li>
		<li>לאחר הדגירה, טיפתית, להוסיף את תערובת transfection לתאים תוך ערבול עדין של הצינור. דגירה במשך 72-96 שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>4. קצירת התאים
<ol><li>יום 5<ol><li>יש להוסיף 33 מ"ל של חיץ ליזה תאי 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), לערבב על ידי ניעור עדין ולדגור ב-37°C למשך שעה וחצי עם טלטול.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 3428 x גרם ב 4 ° C למשך 60 דקות. סנן דרך מסנן ואקום PES של 0.45 מיקרומטר כדי להבהיר את הליזט של התא, והשאר את הליזט המובהר במיכל המסנן. הערה: אופציונלי לאחר סינון: קח 50 μL של דגימה עבור PCR כמותי (Q-PCR).</li>
		<li>הוסף 90 מ"ל של תמיסת 40% PEG 8000 ל- 360 מ"ל של ליזט תאים מסונן.</li>
		<li>נקו את הסורג עם 70% אתנול והוסיפו לדגימה. מערבבים על קרח או בחדר הקר במהירות 300 סל"ד למשך שעה. יש לדגור על טמפרטורה של 4°C מבלי לערבב למשך הלילה. הערה: נבדקו זמני דגירה של שעה עד 72 שעות. לזמני דגירה ארוכים יותר יש השפעה שלילית על כמות המשקעים הכוללת של החלבון.</li>
	</ol></li>
</ol>5. טיהור יודיקסנול
<ol><li>יום 6<ol><li>העבירו את כל דגימת נפח התרבית המואצת של PEG לצינור חרוטי גדול ונקי ולצנטריפוגה במהירות של 2,820 x גרם ו-4°C למשך 15 דקות.</li>
		<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית ה-PEG ב-15 מ"ל של DPBS עם סידן ומגנזיום. קשה לתלות את הגלולה; קח את הזמן לעשות זאת בזהירות.</li>
		<li>העבר את החלק המושעה מחדש לצינור נקי של 50 מ"ל. PEG יישאר בצידי צינור הביוריאקטור. מוסיפים עוד 10 מ"ל, דואגים לאסוף את כל משקע ה-PEG. מעבירים הכל למיכל של 50 מ"ל לנפח כולל של 25-30 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 40 μL של DNaseI (10 U/μL). מניחים באינקובטור למשך שעה אחת ו-37 מעלות צלזיוס. הערה: אופציונלי לאחר הדגירה של DNase: לקחת 50 μL של דגימה עבור Q-PCR.</li>
		<li>חטיפי ערבוב נקיים ששימשו למשקעים PEG היטב עם תמיסת כלוריד ואחריה 70% אתנול. השאירו את החטיפים באתנול 70% לניסוי הבא.</li>
		<li>ממלאים צינור פוליאלומר בגודל 25 מ"מ x 89 מ"מ באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית עם 15.5 מ"ל של ליזט תאי מרוכז בכל צינור. לאחר הוספת ליזט התא, החליפו את פיפטת פסטר הזכוכית בחדשה.</li>
		<li>הוסף תמיסות יודיקסנול מ 15%-60%: להחדיר 9 מ"ל של תמיסת 15% יודיקסנול בעדינות מתחת לליזט התא. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של 25% ו 40% יודיקסנול תמיסות, ולבסוף, להוסיף 5 מ"ל של 60% תמיסת יודיקסנול.</li>
		<li>מעל הצינור באמצעות מזרק עם DPBS +/+ כדי להסיר את רוב בועות האוויר, תוך הקפדה לא להפריע לשכבות יודיקסנול. אטמו את הצינור באמצעות ציפוי צינור חשמלי.</li>
		<li>צנטריפוגה ברוטור ללא נדנדה למשך שעה ו-10 דקות ב-490,000 x גרם ב-16°C באולטרה-צנטריפוגה. מוציאים מאולטרצנטריפוגה, מרכיבים את הצינורות באבזם מתכת ומכינים צינורות איסוף. פתח את הרוטור במכסה המנוע במקרה של שפיכת נוזלים במהלך סיבוב.</li>
		<li>הכינו צינור אחד של 50 מ"ל (להשלכת צינור הרוטור), צינור אחד של 15 מ"ל (לאיסוף וירוסים), מזרק של 5 מ"ל ומחט של 30 גרם ו-19 גרם לכל שיפוע.</li>
		<li>נקב חור בחלק העליון של הצינור עם מחט 30G. השאירו את המחט במקומה. מניחים מחט 19G על המזרק.</li>
		<li>נקב בזהירות את הצינור ממש מתחת לממשק 40% / 60%, אשר ניתן לראות על ידי מחוון פנול אדום. ודא ששיפוע המחט פונה לשכבה של 40%.</li>
		<li>הסר את מחט 30G מראש הצינור באמצעות היד הלא דומיננטית. עם המחט משופעת, לחלץ לאט את הנגיף/יודיקסנול. המטרה היא לחלץ בין 3 מ"ל ל 4.5 מ"ל. בערך באמצע הדרך ועמוק לתוך שכבת 40%/שקופה, סובבו את המחט כך שהשיקוע יפנה כלפי מטה והמשיכו לחלץ כדי למנוע איסוף משכבת החלבון.</li>
		<li>הכינו את הצינור 50 מ"ל ביד הלא דומיננטית, חלצו בזהירות את המחט תוך הנחת הצינור בצינור 50 מ"ל והשליכו. לדלל את תרחיף AAV/יודיקסנול 5x ב- DPBS על ידי מילוי של עד 15 מ"ל.</li>
		<li>מעבירים לצינור מסנן צנטריפוגלי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 3428 x גרם, 4°C למשך 10 דקות. השלכת זרימה; הסירו בעדינות את מחזיק המסנן והטו את המיכל התחתון לתוך בקבוק פסולת. הוסף 15 מ"ל של PBS-5% סוכרוז כדי לסנן ולהשהות מחדש.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 3428 x גרם ב 4 ° C למשך 20 דקות. חזור על חילופי מאגר לפחות 3x. אחסן וירוס (~ 150-250 μL) ב 4 °C (PHP. גרסאות B מקסימום 3 חודשים) או aliquot לתוך 50 μL aliquots ולאחסן ב -80 ° C לטווח ארוך. הערה: PHP. גרסאות B capsid רגישות להקפאה/הפשרה, ולכן יש להימנע מכך.</li>
		<li>בצע טיטרציה כמתואר בפרוטוקול קודם10.</li>
	</ol></li>
</ol>

ייצור AAV פשוט ויעיל באמצעות תרבית מתלים HEK293

<ol>
	<li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases.">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).</li><li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration.">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood&#8211;brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system.">Several rAAV vectors efficiently cross the blood&#8211;brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li><li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset.">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960 (2019).</li><li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li><li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy,+methods+and+protocols.">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li><li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addgene+AAV+data+hub:+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data.">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li><li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li><li>Blessing, D., D&#233;glon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells,+methods+and+protocols.">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li></ol>

מדגם חינם של TransIT סופק על ידי מירוס לבדיקה ראשונית, ולאחר מכן מגיב נרכש לשימוש נוסף. למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים אחרים לדווח עליהם.

ניהול מערכתי של AAV הוא כלי רב עוצמה להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הייצור של AAV הוא תהליך יקר ומייגע. על ידי שימוש בתאי תרחיף, העבודה והפלסטיק מופחתים בהשוואה לתרבית הדבקה של HEK293T על 15 ס"מ2 צלחות. יתר על כן, הצינורות החרוטיים המיושמים כאן קלים לטיפול וממקסמים את השימוש בחלל המ...

וירוס הקשור לאדנו (AAV) התגלה בשנת 1965 ומאז נעשה בו שימוש במספר עצום של יישומים1. AAVs יושמו במחקר מדעי המוח כדי לחקור גנים ותפקוד עצבי, למפות מעגלים עצביים, או לייצר מודלים של בעלי חיים למחלות2. באופן מסורתי, זה נעשה על ידי הזרקה ישירות באתר של עניין, כמו רוב הסרוטיפים הטבעיים אינם חוצים את מחסום הדם-מוח או צריך מינון גבוה לעשות זאת 1,2,3.
עם גילוי AAV. PHP.B4 וקפסידים מהדור הבא כגון AAV. PHP.eB5 ו- AAV. CAP-B106, ניתן לכוון את מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות הזרקה מערכתית פשוטה. מיפוי מרחבי חושף את התאים שאליהם מכוון AAV. PHP.eB ברמה סלולרית 6,7. בשילוב עם מקדמים/משפרים ספציפיים, קפסידים אלה מציעים הזדמנויות נרחבות למדעני מוח לחקור גנים ותפקוד המוח על ידי אספקת AAV לא פולשנית 4,8.
בעוד מינון נמוך יותר נדרש עבור AAV. PHP.eB (בדרך כלל 1 עד 5 x 1011 עותקי גנום (GC) / עכבר) בהשוואה ל- AAV9 (4 x10 12 GC / עכבר)7, עדיין יש לייצר יותר וקטור בהשוואה לאסטרטגיות הזרקה ישירה (בדרך כלל 1 x 109 GC / μL הזרקה). ניתן לייצר את רוב הסרוטיפים הטבעיים באמצעות מערכת תרבית התאים הדבקה הקלאסית בשילוב עם טיהור יודיקסנול 9,10,11,12. עבור AAV. PHP.eB זה כרוך בתהליך עתיר עבודה לתרבית ולהעברת תאים כדי להשיג מספיק וקטורים לניסוי אחד8. לכן, פותח ייצור AAV בתרבית תאי השעיה בצינורות חרוטיים. צינורות חרוטיים, עם קיבולת של עד 300 מ"ל, הם קומפקטיים, חוסך הן שטח אינקובטור פלסטיק. תאי תרחיף הרבה יותר קלים לתרבית ולטיפול בכמויות גדולות מאשר תאים דבקים על לוחות 15 ס"מ. רכיבי הטרנספקציה של הפרוטוקול נשארים זהים. לכן, פלסמידים ששימשו בעבר עם מערכת דבק ניתן בקלות להשתמש בפרוטוקול זה מבוסס על ייצור בתאי ההשעיה. הפרוטוקול הועבר בהצלחה לחוקרים אחרים במעבדה ושימש בהצלחה לקפסידים ומבנים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5920701002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>587633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5820747005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5948000315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I recombinant, RNase-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB12566505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 600 ml cell culture tube</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>66129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Minitron 50 mm</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>500043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-MAX Production Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3583401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Tray Universal</td>
			<td>Infors HT/ TPP</td>
			<td>31321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep - Iodixanol</td>
			<td>Serumwerk bernburg</td>
			<td>1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-VirusGEN</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mir 6706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-50ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin Bioreactors-600ml</td>
			<td>TTP</td>
			<td>87600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Production Cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28932363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-yield adeno associated vector batches using hek293 suspension cells

וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) הם כלי יוצא דופן לחקר מערכת העצבים המרכזית (CNS). קפסידים חדשניים, כגון AAV. PHP.eB, להדגים התמרה נרחבת של CNS על ידי הזרקה תוך ורידי בעכברים. כדי להשיג התמרה דומה, יש צורך בטיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 עותקי גנום / עכבר) בהשוואה להזרקה ישירה בפרנכימה CNS. בקבוצה שלנו, ייצור AAV, כולל AAV. PHP.eB מסתמך על תאי HEK293T דבקים ועל שיטת הטרנספקציה המשולשת. השגת תפוקות גבוהות של AAV עם תאים דבקים כרוכה בתהליך עתיר עבודה וחומר. אילוץ זה הניע פיתוח פרוטוקול לתרבית תאים מבוססת השעיה בצינורות חרוטיים. AAVs שנוצרו בתאים דבקים הושוו לשיטת ייצור התרחיף. תרבית בהשעיה באמצעות ריאגנטים transfection Polyethylenimine או TransIt הושוו. וקטורי AAV טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואחריה חילופי חיץ וריכוז באמצעות מסנן צנטריפוגלי. בשיטה הדבקה השגנו ממוצע של 2.6 x 1012 עותקי גנום (GC), בעוד ששיטת ההשעיה והפוליאתילנימין הניבו 7.7 x 1012 GC בסך הכל, ו- TransIt הניב 2.4 x10 13 GC בסך הכל. אין הבדל ביעילות התמרת vivo בין וקטורים המיוצרים עם דבק בהשוואה למערכת תאי התלייה. לסיכום, פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתרחיף מוצג, וכתוצאה מכך כמות מופחתת של זמן ועבודה הדרושים לייצור וקטורי תוך השגת תפוקות גבוהות פי 3 עד 9 באמצעות רכיבים הזמינים מספקים מסחריים למטרות מחקר.

Adeno-associated virus (AAV) was discovered in 1965 and has since been used in a myriad of applications1. AAVs have been applied in neuroscience research to study gene and neuronal function, map neurocircuits, or produce animal models for disease2. Traditionally, this is done by injecting directly at the site of interest, as most natural serotypes do not cross the blood-brain barrier or need a high dose to do so1,2,3.
With the discovery of AAV.PHP.B4 and next-generation capsids such as AAV.PHP.eB5 and AAV.CAP-B106, it is possible to target the central nervous system (CNS) using a simple systemic injection. Spatial mapping reveals the cells targeted by AAV.PHP.eB at cellular level6,7. In combination with specific promoters/enhancers, these capsids offer extensive opportunities for neuroscientists to study genes and brain function by non-invasive AAV delivery4,8.
While a lower dose is needed for AAV.PHP.eB (typically 1 to 5 x 1011 Genome Copies (GC)/mouse) compared to AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7, still more vector needs to be produced compared to direct injection strategies (typically 1 x 109 GC/&#181;L injection). Most natural serotypes can be produced using the classical adherent cell culture system in combination with iodixanol purification9,10,11,12. For AAV.PHP.eB this entails a labor-intensive process to culture and transfect cells to obtain sufficient vectors for one experiment8. Therefore, the production of AAV in suspension cell culture in conical tubes was developed. Conical tubes, with a capacity of up to 300 mL, are compact, saving both incubator space and plastics. Suspension cells are much easier to culture and handle in large amounts than adherent cells on 15 cm plates. The transfection components of the protocol remain the same. Therefore, plasmids previously used with the adherent system can easily be used in this protocol based on production in suspension cells. The protocol was successfully transferred to other researchers in the laboratory and successfully used for various capsids and constructs.

מחבר זרקור: קידום ריפוי גנטי עם וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה באמצעות גידול תאי השעיה HEK293

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

Our lab uses viral vectors as a platform to deliver therapeutic genes to the injured nervous system. Recently, numerous non-invasive viral vectors which are able to cross the blood-brain barrier have been developed. Use of these vectors requires high titers and therefore an improved production process.The implementation of our HEK293 Suspension Cell Procedure makes this AAV protocol less laborious compared to other adherent cell based systems, while at the same time gaining higher yields of AV vectors. There are no treatments to repair the damage in the central nervous system. We aim to use non-invasive viral vectors to stimulate central nervous system repair.The advantage of this protocol is that we can now produce viral vectors at high yield, which allows us to perform non-invasive therapeutic gene delivery to the injured central nervous system. Our current work will pave the way to develop non-invasive gene therapy for multiple neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis, Parkinson's and Alzheimer's disease.

רוב המעבדות האקדמיות משתמשות בתאי HEK293T דבקים לייצור AAV 8,9. בעוד שזה עובד טוב יחסית כאשר כמויות קטנות של AAV נדרשות להזרקה ישירה, טיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 GC / עכבר) נדרש כדי להשיג התמרה דומה עם capsids מערכתיים כגון AAV. PHP.eB.
בפרוטוקול זה נקבע י...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy with High-Yield AAV Vectors Through HEK293 Suspension Cell Cultivation at JoVE.com

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

המעבדה שלנו משתמשת בווקטורים נגיפיים כפלטפורמה להעברת גנים טיפוליים למערכת העצבים הפגועה. לאחרונה פותחו וקטורים נגיפיים לא פולשניים רבים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח. השימוש בווקטורים אלה דורש טיטרים גבוהים ולכן תהליך ייצור משופר.היישום של הליך תאי ההשעיה HEK293 שלנו הופך פרוטוקול AAV זה לפחות מייגע בהשוואה למערכות מבוססות תאים דבקים אחרות, ובו בזמן צובר תפוקות גבוהות יותר של וקטורי AV. אין טיפולים לתיקון הנזק במערכת העצבים המרכזית. אנו שואפים להשתמש בווקטורים נגיפיים לא פולשניים כדי לעורר תיקון מערכת העצבים המרכזית.היתרון של פרוטוקול זה הוא שאנו יכולים כעת לייצר וקטורים נגיפיים בתפוקה גבוהה, המאפשרת לנו לבצע העברת גנים טיפולית לא פולשנית למערכת העצבים המרכזית הפגועה. העבודה הנוכחית שלנו תסלול את הדרך לפיתוח טיפול גנטי לא פולשני למחלות נוירודגנרטיביות מרובות כגון טרשת נפוצה, פרקינסון ואלצהיימר.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

1.5K Views.  Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW). המעבדה שלנו משתמשת בווקטורים נגיפיים כפלטפורמה להעברת גנים טיפוליים למערכת העצבים הפגועה. לאחרונה פותחו וקטורים נגיפיים לא פולשניים רבים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח. השימוש בווקטורים אלה דורש טיטרים גבוהים ולכן תהליך ייצור משופר.היישום של הליך תאי ההשעיה HEK293 שלנ?...

Video: מחבר זרקור: קידום ריפוי גנטי עם וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה באמצעות גידול תאי השעיה HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.