صمم TZ التجارب. أجرى TZ و VD و SB و JP التجارب. تولت TZ و VD البيانات وحللت البيانات. كتب TZ و YX المخطوطة. قام TZ و GG بمراجعة المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مستشفى UPMC للأطفال في بيتسبرغ.

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol>
	<li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+gene+transfer.">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li><li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+human+gene+therapy.">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li><li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+(AAV)+production.">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757 (2023).</li><li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene.">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Publisher+Correction:+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li><li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14 (2012).</li><li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration.">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li><li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases.">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li><li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles.">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy.">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ-formable,+dynamic+crosslinked+poly+(ethylene+glycol)+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects.">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508 (2023).</li><li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography.">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638 (2020).</li><li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient.">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li></ol>

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول متقدم تقنيا للإنتاج على نطاق واسع لنواقل AAV عالية العيار وعالية الجودة باستخدام منصة مصنع الخلايا (CF10) ، مما يمثل تحسنا كبيرا مقارنة بطرق طبق زراعة الخلايا التقليدية. يبسط استخدام مصانع الخلايا عملية زراعة كميات كبيرة من الخلايا ، مما يسهل إنتاج فيروسات AAV بشكل أكثر كفاءة1. أيضا ، من خلال تحسين ظروف الاستزراع ، لا سيما مع انخفاض الجلوكوز DMEM المكمل ب 10 mM HEPES و 2٪ FBS ، تم تأكيد إنتاج فيروسي محسن بشكل كبير ، مما يشير إلى الدور الحاسم للبيئة الخلوية في إنتاج الفيروس.
يعالج بروتوكول التنقية المنقح ، الذي يجمع بين AAV من كل من كريات الخلايا ووسائط الاستزراع ، القضية الشائعة المتمثلة في انخفاض غلة الفيروس والشوائب التي شوهدت في العديد من البروتوكولات الحالية. خطوات استخراج الكلوروفورم والتقسيم المائي على مرحلتين تزيل بشكل فعال معظم ملوثات البروتين ، مع بقاء AAV قابلة للذوبان في مرحلة كبريتات الأمونيوم. يمكن أن يعزى التحسن في كل من إنتاجية ونقاء ناقلات AAV باستخدام التقسيم ثنائي الطور PG / المائي جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي الفائق للتدرج اليوديكسانول ، على عكس طرق الطرد المركزي الفائق المتدرجة التقليدية ، إلى الفصل الأولي المعزز باستخدام PEG / التقسيم المائي على مرحلتين ، والنقاء المكرر باستخدام الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول وتقليل التنقية المشتركة للملوثات12. أولا ، إدخال PEG / التقسيم المائي على مرحلتين قبل الطرد المركزي الفائق يحسن بشكل كبير الفصل الأولي لجزيئات AAV من الحطام الخلوي والملوثات الأخرى. PEG ، بوليمر عالي الوزن الجزيئي ، عند مزجه بمحلول مائي ، يخلق مرحلتين متميزتين13. تميل ناقلات AAV إلى التقسيم بشكل تفضيلي إلى إحدى هذه المراحل (عادة المرحلة الغنية ب PEG) ، بينما يتم تقسيم العديد من الملوثات والشوائب إلى13 مرحلة أخرى. يركز هذا التقسيم الانتقائي بشكل فعال جزيئات AAV ويزيل جزءا كبيرا من الشوائب حتى قبل الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي زيادة العائد وتقليل حمل الملوثات الذي يدخل خطوةالطرد المركزي الفائق 13. ثانيا ، يعمل الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول على تحسين نقاء ناقلات AAV. يسمح Iodixanol ، وهو وسيط تدرج غير أيوني ، متساوي الأسمولية ، بفصل أكثر لطفا وتحكما مقارنة بتدرجات CsCl التقليدية14. في هذا التدرج ، تهاجر جزيئات AAV إلى موضع في التدرج يتوافق مع كثافة الطفو14. والأهم من ذلك ، أن هذه العملية فعالة في فصل قفيصات AAV الكاملة (التي تحتوي على الحمولة الجينية) عن القفيصات الفارغة (التي تفتقر إلى المادة الوراثية) ، وهو محدد حاسم لجودة النواقل. تحافظ طبيعة الأيزو أسمولار في يوديكسانول أيضا على سلامة قفيصات AAV بشكل أفضل من العوامل المفرطة الأسمولية مثل CsCl ، مما قد يؤدي إلى زيادة غلة النواقل الوظيفيةالسليمة 14. أخيرا ، يمكن لطرق الطرد المركزي الفائقة التقليدية ، خاصة تلك التي تستخدم تدرجات CsCl ، في بعض الأحيان أن تشارك في تنقية الملوثات التي لها كثافات طفو مماثلة لناقلات AAV15. باستخدام تقسيم PEG كخطوة أولية ، يتم تقليل حمل هذه الملوثات بشكل كبير قبل الطرد المركزيالفائق 13. هذا الانخفاض في حمل الملوثات يعني أن تدرج اليوديكسانول يمكن أن يعمل بشكل أكثر فعالية وانتقائية في تنقية ناقلات AAV ، مما يؤدي إلى نقاء أعلى15.
يتم تقييم نقاء وجودة ناقلات AAV بدقة من خلال تلطيخ الفضة و TEM11. تشير ملاحظة ثلاثة نطاقات رئيسية تتوافق مع بروتينات قفيصة AAV VP1 و VP2 و VP3 ، بنقاوة تتجاوز 90٪ ، إلى مدى ملاءمة ناقلات AAV هذه للاستخدام في الجسم الحي . يعد تحليل TEM لتحديد نسبة القفيصة الكاملة إلى الفارغة أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص ، حيث يمكن أن تؤدي نسبة عالية من القفيصات الفارغة إلى انخفاض كفاءة توصيل الجينات والاستجابات المناعية المحتملة11. وعلى الرغم من أن فحص الجودة هذا ضروري، إلا أنه يزيد من التعقيد الإجرائي وقد يتطلب خبرة تقنية إضافية.
في الختام ، يقدم البروتوكول تطورات تقنية كبيرة في إنتاج ناقلات AAV ، لا سيما من حيث قابلية التوسع والنقاء. ومع ذلك ، فإن التعقيدات المرتبطة بعملية التنقية والحاجة إلى المعدات والخبرات المتخصصة قد لا تزال تشكل قيدا بسيطا على تطبيقها في بعض إعدادات البحث. ومن شأن المزيد من الصقل والتبسيط لهذه التقنيات أن يجعل هذا النهج أكثر سهولة وقابلية للتطبيق على نطاق واسع في مجال أبحاث العلاج الجيني.

أصبحت ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) أداة لا غنى عنها في أبحاث العلاج الجيني ، حيث تقدم مزيجا فريدا من الفعالية والسلامة لتوصيل الجينات1. كانت الطرق التقليدية لتوليد AAVs في الإعدادات المختبرية محورية في تعزيز فهمنا وتطبيقنا للعلاج الجيني2. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ، على الرغم من أنها أساسية ، تظهر بعض القيود والتحديات ، لا سيما من حيث العائد وكفاءة الوقت وجودة النواقل المنتجة ، ولا سيما نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيماتالفارغة 3.
يتضمن الإجراء التقليدي لإنتاج AAV في المقام الأول نقل خلايا HEK2934. تتطلب هذه العملية ، التي تتم عادة في أطباق زراعة الخلايا ، نقل الخلايا ببلازميد يحتوي على الجين محل الاهتمام جنبا إلى جنب مع البلازميد المساعد وبلازميد القفيصة AAV 5,6. بعد النقل ، تنتج الخلايا جزيئات AAV ، والتي يتم حصادها وتنقيتهابعد ذلك 5,6. غالبا ما تتضمن عملية التنقية الطرد المركزي الفائق ، وهي خطوة حاسمة في الحصول على ناقلات AAV عالية النقاء7. يعد الطرد المركزي الفائق ، خاصة باستخدام كلوريد السيزيوم (CsCl) أو تدرج اليوديكسانول ، طريقة قياسية لفصل جزيئات AAV عن الحطام الخلوي والشوائب الأخرى8. هذه الخطوة ضرورية لتحقيق النقاء والتركيز المطلوبين لنواقل AAV ، مما يؤثر بشكل مباشر على فعاليتها في توصيل الجينات8. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع ، فإن أجهزة الطرد المركزي الفائقة التقليدية لها عيوبها. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون إنتاجية ناقلات AAV من هذه الطريقة متغيرة وغالبا ما تكون منخفضة ، مما يشكل تحديات كبيرة عندما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة من ناقلات العيار العالي ، خاصة للدراسات في الجسم الحي أو النماذج الحيوانية الكبيرة9.
جانب آخر مهم لجودة ناقل AAV هو نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيماتالفارغة 10. غالبا ما تحتوي مستحضرات AAV على مزيج من هذه الجسيمات ؛ ومع ذلك ، تحتوي الجسيمات الكاملة فقط على المادة الوراثية العلاجية. يمكن أن يؤدي وجود نسبة عالية من الجسيمات الفارغة إلى تقليل كفاءة توصيل الجينات بشكل كبير10. وبالتالي فإن تقييم وتحسين نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيمات الفارغة هو معلمة رئيسية في تقييم فعالية ناقلات AAV. الطرق التقليدية ، على الرغم من قدرتها على إنتاج ناقلات AAV ، غالبا ما تكافح للسيطرة على هذه النسبة باستمرار ، مما يؤدي إلى اختلافات في قوة المتجهات10.
هنا ، يتم تقديم طريقة فريدة من نوعها ، والتي تبسط عملية توليد ناقلات AAV عالية الغلة وعالية النقاء باستخدام منصة مصنع الخلايا الخالية من استخدام مزارع الخلايا HEK293T كثيفة العمالة في أطباق الخلايا ، ودمج التقسيم ثنائي الطور من البولي إيثيلين جلايكول / المائي مع الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول. يتم تأكيد نقاء ناقل AAV عبر SDS-PAGE وتلطيخ الفضة ، ويتم تحديد نسبة الجسيمات الكاملة إلى الفارغة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، مما يلبي معايير الجودة للدراسات في الجسم الحي 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>324506-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Henke-Ject syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% pluronic F68 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>24-040-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% Precast Protein Gels</td>
			<td>biorad</td>
			<td>4561094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% PEG solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1458-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6 reference full capsids</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV6-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;PES Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Cassettes, 10 K MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-569-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10567022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9732-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest Biofactory 10 chamber</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>771302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-420-DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-RC6</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI Max</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>49553-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.07242.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickSeal tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9144589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1162245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a streamlined and standardized procedure for generating high-titer, high-quality adeno-associated virus vectors utilizing a cell factory platform

تتطلب أبحاث العلاج الجيني قبل السريرية ، لا سيما في القوارض والنماذج الحيوانية الكبيرة ، إنتاج ناقلات AAV ذات إنتاجية عالية ونقاوة. غالبا ما تتضمن الأساليب التقليدية في مختبرات الأبحاث استخداما مكثفا لأطباق زراعة الخلايا لزراعة الخلايا HEK293T ، وهي عملية يمكن أن تكون شاقة وإشكالية. هنا ، يتم تقديم طريقة داخلية فريدة ، والتي تبسط هذه العملية باستخدام منصة مصنع خلايا معينة (أو مداخن الخلايا ، CF10). يؤدي تكامل التقسيم ثنائي الطور من البولي إيثيلين جلايكول / المائي مع الطرد المركزي الفائق المتدرج لليوديكسانول إلى تحسين كل من إنتاجية ونقاء ناقلات AAV المتولدة. يتم التحقق من نقاء ناقلات AAV من خلال SDS-PAGE وتلطيخ الفضة ، في حين يتم تحديد نسبة الجسيمات الكاملة إلى الفارغة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). يوفر هذا النهج منصة فعالة لمصنع الخلايا لإنتاج ناقلات AAV بإنتاجية عالية ، إلى جانب طريقة تنقية محسنة لتلبية متطلبات الجودة للدراسات في الجسم الحي .

Adeno-associated virus (AAV) vectors have become an indispensable tool in gene therapy research, offering a unique combination of efficacy and safety for gene delivery1. Traditional methods for generating AAVs in laboratory settings have been pivotal in advancing our understanding and application of gene therapy2. However, these methods, while foundational, exhibit certain limitations and challenges, especially in terms of yield, time efficiency, and the quality of the vectors produced, notably the ratio of full to empty particles3.
The conventional procedure for AAV production primarily involves the transfection of HEK293 cells4. This process, typically conducted in cell culture dishes, requires the cells to be transfected with a plasmid containing the gene of interest along with helper plasmid&#160;and AAV capsid plasmid5,6. Following transfection, the cells produce AAV particles, which are then harvested and purified5,6. The purification process often involves ultracentrifugation, a critical step in obtaining high-purity AAV vectors7. Ultracentrifugation, particularly using cesium chloride (CsCl) or iodixanol gradient, is a standard method for separating AAV particles from cellular debris and other impurities8. This step is crucial for achieving the desired purity and concentration of AAV vectors, which directly impacts their efficacy in gene delivery8. Despite its widespread use, traditional ultracentrifugation has its drawbacks. For example, the yield of AAV vectors from this method can be variable and often low, which poses significant challenges when large quantities of high-titer vectors are needed, particularly for in vivo studies or large animal models9.
Another critical aspect of AAV vector quality is the ratio of full to empty particles10. AAV preparations often contain a mixture of these particles; however, only the full particles contain the therapeutic genetic material. The presence of a high proportion of empty particles can significantly reduce the efficiency of gene delivery10. Assessing and optimizing the ratio of full to empty particles is thus a key parameter in evaluating the efficacy of AAV vectors. Traditional methods, while capable of producing AAV vectors, often struggle to control this ratio consistently, leading to variations in vector potency10.
Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform free from using labor-intensive HEK293T cell cultures in cell dishes, integrating polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation. The AAV vector purity is confirmed via SDS-PAGE and silver staining, and the full-to-empty particle ratio is determined using transmission electron microscopy (TEM), meeting the quality standards for in vivo studies11.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

إجراء مبسط وموحد لتوليد ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدينو عالية الجودة باستخدام منصة مصنع الخلايا

في هذا البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة ، يتم عرض منصة موحدة لصنع فيروس AAV عالي الجودة وعالي الجودة مع CF10 في بيئة معملية أبحاث واسعة النطاق. بالمقارنة مع أطباق زراعة الخلايا التقليدية ، يوفر CF10 طريقة ملائمة لزراعة كميات كبيرة من الخلايا وإنتاج فيروس AAV (الشكل 1). تم اختبار العديد من ظروف المزرعة لتحديد ما إذا كانت الخلايا في البيئة المثلى يمكن أن تعزز الإنتاج الفيروسي. أظهر DMEM منخفض الجلوكوز المكمل ب 10 mM HEPES و 2٪ FBS أفضل إنتاج AAV.
تم اختبار العديد من البروتوكولات لتنقية AAVs. معظم الإجراءات لها غلة منخفضة من الفيروس وشوائب قفيصة AAV. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية منقح ، يجمع بين AAV من كل من كريات الخلايا ووسائط الاستزراع (الشكل 2). لقد وجدنا أن 80٪ من AAV كانت في الخلايا ، و 20٪ أخرى من AAV كانت في وسائط الثقافة ، والتي تم إفرازها من الخلايا. تمت معالجة كلا الجزأين من AAV باستخدام DNase لإزالة الحمض النووي الحر. تم استخدام ديوكسي كولات الصوديوم لمزيد من إطلاق AAV من الخلايا. ثم تم استخراج AAVs باستخراج الكلوروفورم متبوعا بتقسيم مائي على مرحلتين. سمحت هذه الخطوات بإزالة معظم ملوثات البروتين. AAV لا يزال قابل للذوبان في مرحلة كبريتات الأمونيوم.
تمت إزالة الملوثات المتبقية باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج لليوديكسانول المتقطع (الشكل 3 أ). كان التدرج مفيدا أيضا في إزالة قفيصات AAV الفارغة ، خاصة مع الجولة الثانية من الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول.
تم تحديد نقاء فيروس AAV عن طريق تلطيخ الفضة. عندما تم الحصول على ثلاثة نطاقات رئيسية تتوافق مع بروتين قفيصة AAV ، VP1 و VP2 و VP3 ، بنقاوة أكبر من 90٪ ، كان فيروس AAV مناسبا للاستخدام في الجسم الحي (الشكل 3B). تم الوصول إلى نسبة القفيصة الكاملة AAV إلى القفيصة الفارغة بواسطة TEM (الشكل 3C). فقط قفيصة كاملة مع إدخال جين التحوير من شأنه أن يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة في الأنسجة المستهدفة. يمكن أن يؤدي جزء كبير من القفيصة الفارغة أيضا إلى استجابة مناعية لقفيصة AAV. تعد فحوصات الجودة هذه ضرورية لكل فيروس AAV يتم إنتاجه وتنقيته قبل الاستخدام.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لإنتاج AAV بواسطة طريقة النقل الثلاثي للخلايا HEK293T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg"> الشكل 2: رسم تخطيطي لتنقية AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg"> الشكل 3: تنقية AAV عن طريق الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول والتحقق من نقاء فيروس AAV. (أ) طبقات تدرج اليوديكسانول وموضع الإبرة للحصاد. (ب) جل تمثيلي يقيم محتوى القفيصة ونقاوتها. M: علامة جزيئية. R: مرجع AAV6 قفيصة كاملة ؛ S1: قفيصة AAVDJ مصنوعة داخليا مع جولة واحدة من الطرد المركزي الفائق ؛ S2: قفيصة AAVDJ مصنوعة داخليا مع جولتين من الطرد المركزي الفائق ؛ S3: قفيصة AAV6 مصنوعة داخليا. ج: صورة المجهر الإلكتروني ل AAV. الفيروس الذي تم جمعه بعد التنقية. تظهر القفيصات الفيروسية التي تحتوي على جينوم فيروسي على شكل أشكال سداسية بيضاء متجانسة ، بينما تظهر القفيصات الفارغة على شكل أشكال سداسية ذات حافة بيضاء ولكن مركزها مظلم. شريط المقياس: 100 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: حاسبة PEI لتغليف AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: مخطط حجم خام AAV-PEG-Sulfate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: تحضير تدرج اليوديكسانول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 4: تحضير الجولة الثانية من تدرج اليوديكسانول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 5: بادئات المعايرة بالتحليل الحجمي AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الملف التكميلي 1: تركيبات المخازن المؤقتة المستخدمة للدراسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production at JoVE.com

مع استمرار تطور مجال العلاج الجيني ، هناك حاجة متزايدة لطرق مبتكرة يمكنها مواجهة هذه التحديات. هنا ، يتم تقديم طريقة فريدة من نوعها ، والتي تبسط عملية توليد ناقلات AAV عالية الغلة وعالية النقاء باستخدام منصة مصنع الخلايا ، وتلبية معايير الجودة للدراسات في الجسم الحي .

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

يهدف هذا المشروع إلى توفير بروتوكول نويل للإنتاج على نطاق واسع من ناقلات الفيروسات عالية العيار وعالية النقاء المرتبطة بالغدي باستخدام منصة مصنع الخلايا والظروف الثقافية المحسنة. تجمع عملية التنقية المنقحة بين AEV من كل من كسور الخلايا وعلامة التوظيف على مرحلتين ، تليها عملية التدرج لدينا لتحقيق إنتاجية ونقاء فائقين. على الرغم من التقدم الأخير ، لا تزال هناك بعض التحديات في مختبرات البحث الأكاديمي.وتشمل هذه تحسين ظروف الثقافة القابلة للتطوير ، واستخدام خلايا أخرى ، وتقليل النسبة المئوية للقفيصات الفارغة ، وتحقيق التوازن بين العائد الفيروسي والنقاء. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، يوفر بروتوكولنا قابلية التوسع عبر مصانع الخلايا ، وزيادة الغلة مع ظروف الاستزراع المحسنة ، وتعزيز نقاء ناقل الفيروس المرتبط بالغدي من خلال عملية تنقية نويل المكونة من خطوتين. مهد هذا البروتوكول القابل للتطوير مع النقاء الفيروسي المرتبط بالغدي الطريق لدراسات أكبر قبل السريرية في مختبرات الأبحاث الأكاديمية.من المحتمل أن يؤدي إلى تطوير علاج جيني أكثر أمانا وفعالية بسبب تحسين جودة النواقل.

a-streamlined-standardized-procedure-for-generating-high-titer-high

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

909 Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. يهدف هذا المشروع إلى توفير بروتوكول نويل للإنتاج على نطاق واسع من ناقلات الفيروسات عالية العيار وعالية النقاء المرتبطة بالغدي باستخدام منصة مصنع الخلايا والظروف الثقافية المحسنة. تجمع عملية التنقية المنقحة بين AEV من كل من كسور الخلايا وعلامة التوظيف على مرحلتين ، تليها ع?...

Video: Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. Traditional approaches in research laboratories often involve extensive use of cell culture dishes to cultivate HEK293T cells, a process that can be both laborious and problematic. Here, a unique in-house method is presented, which simplifies this process with a specific cell factory (or cell stacks, CF10) platform. An integration of polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation improves both the yield and purity of the generated AAV vectors. The purity of the AAV vectors is verified through SDS-PAGE and silver staining, while the ratio of full to empty particles is determined using transmission electron microscopy (TEM). This approach offers an efficient cell factory platform for the production of AAV vectors at high yields, coupled with an improved purification method to meet the quality demands for in vivo studies.

As the field of gene therapy continues to evolve, there is a growing need for innovative methods that can address these challenges. Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform, meeting the quality standards for in vivo studies.

Transfection and Harvesting Adeno-Associated Virus Vectors Using HEK293T Cells for Gene Therapy

To begin, seed HEK293T cells into a 10-layer Cell Factory containing DMEM high-glucose media with 10%FBS. Place the cells in an incubator at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide supplementation overnight. Next, aliquot 350 milliliters of Opti-MEM into a sterile 500-milliliter bottle.Add the plasma DNA for transfection into the bottle and shake to mix well. Now add 15 milliliters of PEI solution into the bottle. Shake the mixture vigorously for 30 seconds to ensure even mixing.After incubating the mixture at room temperature for 15 minutes, transfer it to a one-liter bottle. Then add 700 milliliters of low-glucose DMEM. Remove the 10-layer Cell Factory from the incubator and vacuum the media into a waste container.Carefully pipette the DNA transfect mixture into the Cell Factory. Then place the Cell Factory back in the incubator for 72 to 96 hours. After three to four days, filter the clarified supernatant through a 0.45-micrometer filter unit.Add 500 milliliters of DPBS into the Cell Factory to rinse it. Centrifuge it at 4, 000 g for 20 minutes at four degrees Celsius. With a vacuum system and an aspirating pipette, remove and discard the supernatant.Add 20 milliliters of AAV Lysis Buffer to the pellet and mix to resuspend the pellet in the buffer. Store at minus 80 degrees Celsius until purification. Now add 40%PEG sodium chloride solution to the AAV solution, making the final concentration up to 8%PEG.Place the mixture on a low-speed orbital rotator overnight at four degrees Celsius. Centrifuge of the solution at 4, 000 g for 30 minutes at four degrees Celsius to precipitate the virus. Pipette out the supernatant.Then had five to 10 milliliters of AAV HEPES Resuspension Buffer to the pellet. Transfer the suspension into a 50-milliliter conical tube to continue the downstream purification. Next, fix a 16-gauge punted needle fitted on a 10-milliliter syringe and overlay the prepared iodixanol gradients into a round-top polypropylene ultracentrifuge tube.With a 22-gauge needle, carefully add up to 17 milliliters of the AAV solution on top of the gradient. Top off the tube with AAV Dialysis Buffer. Seal the tubes with an electric sealer.Centrifuge the tubes at 350, 000 g for two hours in a titanium rotor at four degrees Celsius. Then transfer them into an ultracentrifuge tube rack. Now use a new 18-gauge needle to transfer the AAV virus into a dialysis cassette.Remove the air from the cassette after injecting the virus into it. Place a stir bar in the beaker containing the AAV Dialysis Buffer and transfer it onto a stir plate. Then place the dialysis cassette in the buffer with a float buoy.Use a 10-milliliter syringe to transfer the virus from the cassette into a centrifugal filter unit. Centrifuge at 4, 000 g for 15 to 30 minutes at four degrees Celsius. Collect the concentrated AAV from the filter unit.Then rinse the filter with 300 microliters of AAV Dialysis Buffer. Finally, transfer the rinse solution to the concentrated AAV. The isolated AVV virus was found to have a purity greater than 90%rendering it suitable for in vivo usage.