تركز مجموعتي البحثية على البيولوجيا الجزيئية الأساسية والكيمياء الحيوية لخطوط تجميع التخليق الحيوي في البكتيريا. هدفنا هو هندسة البكتيريا لصنع مضادات حيوية جديدة. نحن متحمسون لجلب هذا العمل إلى الفصل الدراسي ، وتزويد الطلاب بخبرة عملية في أحدث التقنيات في التكنولوجيا الحيوية.
يستخدم الاستنساخ القائم على Topoisomerase حاليا في الفصل الدراسي للبيولوجيا الجزيئية الجامعية في Cal Poly لتعريف الطلاب بالاستنساخ الجزيئي. برزت Gibson Assembly كتقنية استنساخ جزيئي ذات صلة صناعيا ، ونحن نحاول تزويد الطلاب بالخبرات القابلة للتطبيق. الاستنساخ الجزيئي هو تقنية قد يكون من الصعب تصورها في الفصل الدراسي الجامعي التقليدي.
لقد صممنا وحدة مختبرية عملية يقوم فيها الطلاب بتصميم وتقييم تجربتهم بالإضافة إلى المساهمة في مشاريع بحثية أصيلة. وهذا يعزز فهمهم لعملية الاستنساخ وتطبيقات عملهم. في حين تم نشر تجارب بحثية جامعية أخرى قائمة على الدورات التدريبية باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي ، إلا أن أيا منها لا يتضمن وحدة تجميع جيبسون قابلة للتكيف.
لقد صممنا جميع المواد لقياس نتائج التعلم لهذه التجربة البحثية الجامعية القائمة على الدورة. نأمل أن يكون هذا بمثابة أداة تعليم العلوم سهلة التنفيذ لتحسين تقييم المعلم وتعليم الطلاب في مختبرات البيولوجيا الجزيئية على مستوى الكلية. للبدء ، حدد مصدر قالب الحمض النووي لإدخالات الجينات ، مثل الحمض النووي الجيني أو البلازميد أو الحمض النووي الاصطناعي.
استرجع تسلسل الحمض النووي لإدخالات الجينات والناقلات. قم باستيراد تسلسلات الإدراج وتسلسلات المتجهات المطلوبة إلى Benchling كملفات تسلسل DNA جديدة. ثم افتح كل تسلسل مستورد لاستخدامه في تفاعل تجميع جيبسون.
الآن حدد موقع أداة معالج التجميع في الجزء السفلي من الشاشة. انقر فوق معالج التجميع، ثم حدد إنشاء تجميع جديد. من الخيارات المتوفرة ، حدد Gibson ، وانقر فوق ابدأ لبدء التجميع.
في نافذة تسلسل المتجه، حدد قواعد العمود الفقري للمتجهات بدءا من الطرف الأساسي 3 لإدراج الجين إلى نقطة النهاية المطلوبة. بمجرد التحديد ، انقر فوق العمود الفقري علامة التبويب في أسفل الشاشة واختر تعيين جزء. في نافذة إدراج تسلسل، حدد جميع قواعد الإدراج المراد تضمينها في التجميع.
بمجرد التحديد ، انقر فوق إدراج علامة التبويب في أسفل الشاشة واختر تعيين جزء. إذا كانت هناك العديد من إدخالات الجينات ، فانقر فوق زر علامة الجمع على الجانب الأيمن من معالج التجميع. في النافذة Insert Sequence، حدد جميع القواعد للإدراج الإضافي المراد تضمينه في التجميع.
بمجرد التحديد ، انقر فوق إدراج علامة التبويب في أسفل الشاشة واختر تعيين جزء. بمجرد تعيين جميع الأجزاء ، أعد تسمية التجميع إلى اسم البلازميد المطلوب. انقر فوق تجميع على الجانب الأيسر من معالج التجميع.
ثم حدد موقع المجلد المطلوب لكل من مجلد التسلسل والمجلد التمهيدي ، وانقر فوق إنشاء لتجميع تسلسل البلازميد المؤتلف. الآن افتح البلازميد المجمع وانقر فوق محفوظات التجميع لعرض خريطة البلازميد الأساسية ونظرة عامة على التسلسلات التي اشتقت منها. في علامة التبويب معلمات التجميع، اعرض أسماء البادئات المصممة للتجميع.
تأكد من وجود نوعين من البادئات لكل إدراج وأن أسماء التمهيدي مشتقة من عناوين ملفات تسلسل الحمض النووي. تأكد من توافق درجات حرارة ذوبان التمهيدي ودرجات حرارة التلدين المقترحة. بمجرد اكتمال التصميم التمهيدي للبلازميدات المطلوبة، انقر فوق إنهاء في معالج التجميع.
باستخدام تجربة PCR المتدرجة مع قوالب الحمض النووي ، اختبر كلا من أزواج التمهيدي المدخلة والخاصة بالمتجهات للحصول على درجات حرارة التلدين المثلى. بمجرد تحديد درجات حرارة التلدين ، قم بإنشاء حصصات من المحاليل التمهيدية وقوالب الحمض النووي والكواشف اللازمة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للطلاب. للبدء ، احصل على البادئات وقوالب حلول الحمض النووي ل تفاعل البوليميراز المتسلسل من المدرب.
باستخدام الكواشف الموضحة هنا ، قم بإعداد تفاعلات PCR سعة 25 ميكرولتر للحصول على شظايا خطية من تسلسلات الحمض النووي المرغوبة. قم بتدوير التفاعل في الدراجة الحرارية. تأكد من أن درجة حرارة التلدين مناسبة للبادئات وأن وقت التمديد مناسب لطول المضخم المطلوب.
بعد ذلك ، قم بتحليل خمسة ميكرولترات من كل تفاعل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. أثناء تشغيل الجل ، أضف ميكرولتر واحدا من إنزيم تقييد DpnI إلى كل تفاعل استخدم الحمض النووي البلازميدي كقالب. احتضن هذا الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
ثم قم بتصوير الجل للتأكد من نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل وتم تحقيق التضخيم الصحيح. قم بتنقية أي تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجحة باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوفرة تجاريا. قم بقياس تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم لاستخدامه في حسابات تجميع جيبسون اللاحقة.
ماصة مكونات تفاعل تجميع جيبسون. احتضان التفاعل عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أثناء احتضان التفاعلات ، قم بإذابة خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا على الجليد للتحول.
قم بتحويل ميكرولترين من تفاعل تجميع جيبسون إلى خلايا مختصة كيميائيا عبر الصدمة الحرارية. ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على لوحين اختيار وتنتشر بالخرز المعقم. احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، قم بتخزين الطبق عند أربع درجات مئوية. ثم عد المستعمرات على جميع اللوحات ، واحسب كفاءة التحويل باستخدام الصيغة المحددة. باستخدام علامة ، حدد أربع مستعمرات مميزة على لوحة التحديد وقم بتسمية الأحرف الأولى من اسم الطالب ورقم.
خذ طبق أجار LB جديد يحتوي على مضادات حيوية للاختيار وقسمها إلى أرباع. استخدم ما يقرب من نصف كل مستعمرة للعودة إلى الربع المعني. أضف تركيز المضادات الحيوية الصحيح إلى الأنابيب المسمى بهوية المستعمرة للاختيار.
ثم قم بتلقيح ثقافة LB سائلة سعة خمسة ملليلتر مع النصف الآخر من كل من المستعمرات الأربع المختارة. احتضان المزارع السائلة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية طوال الليل ولوحة الأجار في حاضنة ثابتة عند نفس درجة الحرارة. اعزل الحمض النووي البلازميد من المزارع السائلة باستخدام مجموعة تحضير صغيرة.
قياس تركيز الحمض النووي البلازميد المعزول بالنانوجرام لكل ميكرولتر. بعد تصميم شاشة PCR لتحليل البلازميدات المعزولة ، قم بعمل ماصة تفاعلات هضم التقييد ، أو تفاعلات PCR. ثم قم بتحليل النتائج عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام.
بمجرد اكتمال وحدة تجميع جيبسون ، اطلب من الطلاب المشاركين إكمال استبيان الاختيار من متعدد في اجتماع المختبر. اجمع جميع البيانات من إجابات الاستبيان قبل وبعد الاستبيان لتحليلها ، وقم بتقييم أهميتها الإحصائية. بعد المشروع ، ارتفع متوسط درجة المحتوى بشكل ملحوظ من 63.7٪ إلى 80.4٪ مما يشير إلى تحسن فهم الطلاب للبيولوجيا الجزيئية ومفاهيم الاستنساخ.
زاد متوسط ثقة المصطلح بشكل ملحوظ من 3.52 إلى 3.87 ، مع حجم تأثير كبير يدل على تحسين فهم الطلاب لمصطلحات البيولوجيا الجزيئية. زادت ثقة الطالب العادي في أداء التقنيات المعملية بشكل ملحوظ من 3.82 إلى 4.33 ، مما يدل على راحة معززة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية. زاد عدد الردود التي تشير إلى الإلمام بمصطلح تجميع جيبسون بشكل ملحوظ من الاستبيان قبل الاستبيان إلى ما بعد ، مع ارتفاع ملحوظ في أولئك الذين يمكنهم شرح المصطلح.
تحسنت الثقة في أداء تقنية تجميع جيبسون مع معظم الردود ، وتحولت من الحياد أو الاختلاف قبل الجلسة إلى الموافقة أو الموافقة بقوة بعد ذلك. لم تظهر ثقة الطلاب في موضوعات علم الأحياء العامة أي تغييرات ذات دلالة إحصائية. في المقابل ، زادت الثقة في أسئلة تجميع جيبسون المتخصصة بشكل كبير.
