קבוצת המחקר שלי מתמקדת בביולוגיה מולקולרית בסיסית ובביוכימיה של פסי ייצור ביוסינתטיים בחיידקים. המטרה שלנו היא להנדס חיידקים כדי לייצר אנטיביוטיקה חדשה. אנו נלהבים להביא עבודה זו לכיתה, לספק לתלמידים ניסיון מעשי בטכניקות חדשניות בביוטכנולוגיה.
שיבוט מבוסס טופואיזומראז משמש כיום בכיתה לתואר ראשון בביולוגיה מולקולרית של Cal Poly כדי להציג לתלמידים שיבוט מולקולרי. Gibson Assembly התפתחה כטכניקת שיבוט מולקולרית רלוונטית מבחינה תעשייתית, ואנו מנסים לספק לתלמידים חוויות ישימות . שיבוט מולקולרי הוא טכניקה שיכולה להיות קשה להמשיג בכיתה מסורתית לתואר ראשון.
עיצבנו מודול מעבדה מעשי שבו התלמידים מתכננים ומעריכים את הניסוי שלהם, כמו גם תורמים לפרויקטים מחקריים אותנטיים. זה משפר את הבנתם את תהליך השיבוט ואת היישומים של עבודתם. בעוד שהתנסויות מחקר אחרות לתואר ראשון המבוססות על קורסים תוך שימוש בטכניקות שיבוט מולקולרי פורסמו, אף אחת מהן אינה כוללת מודול הרכבה של גיבסון הניתן להתאמה.
עיצבנו את כל החומרים כדי למדוד את תוצאות הלמידה עבור ניסיון מחקר זה מבוסס קורס לתואר ראשון. אנו מקווים שזה ישמש ככלי חינוכי מדעי קל ליישום לשיפור הערכת המדריכים והכשרת התלמידים במעבדות ביולוגיה מולקולרית ברמת מכללה. כדי להתחיל, קבע את מקור תבנית ה- DNA עבור תוספות הגן, כגון DNA גנומי, פלסמיד או DNA סינתטי.
אחזור רצפי הדנ"א של תוספות הגן והווקטור. ייבא את רצפי ההוספה הרצויים ואת הרצפים הווקטוריים הרצויים ל- Benchling כקובצי רצף DNA חדשים. לאחר מכן פתח כל רצף מיובא לשימוש בתגובת ההרכבה של גיבסון.
כעת אתר את כלי אשף ההרכבה בתחתית המסך. לחץ/י על ״אשף ההרכבה״ ולאחר מכן בחר/י ״צור הרכבה חדשה״. מתוך האפשרויות המוצגות, בחר Gibson ולחץ על התחל כדי להתחיל בהרכבה.
בחלון רצף וקטורי, בחר את בסיסי עמוד השדרה הווקטורי החל מ-3 הקצה הראשוני של הוספת הגן לנקודת הקצה הרצויה. לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה עמוד שדרה בתחתית המסך ובחר הגדר מקטע. בחלון Insert Sequence, בחר בכל בסיסי ההוספה שייכללו בהרכבה.
לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה הוספה בתחתית המסך ובחר הגדר מקטע. אם יש מספר תוספות גנים, לחץ על לחצן הפלוס בצד ימין של אשף ההרכבה. בחלון Insert Sequence, בחר את כל הבסיסים להוספה הנוספת שתיכלל בהרכבה.
לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה הוספה בתחתית המסך ובחר הגדר מקטע. לאחר שכל השברים מוגדרים, שנה את שם ההרכבה לשם הפלסמיד הרצוי. לחץ על הרכיב בצד השמאלי של אשף ההרכבה.
לאחר מכן בחרו במיקום הרצוי לתיקיית הרצף ולתיקיית הפריימר, ולחצו על 'צור' להרכבת רצף הפלסמיד הרקומביננטי. כעת פתח את הפלסמיד שהורכב ולחץ על היסטוריית הרכבה כדי להציג מפת פלסמיד בסיסית וסקירה כללית של הרצפים שמהם הוא נגזר. בכרטיסיה פרמטרים של הרכבה, הצג את שמות הפריימרים המיועדים להרכבה.
ודא שיש שני פריימרים לכל עלון וששמות פריימרים נגזרים מכותרות הקבצים של רצף ה- DNA. ודא שטמפרטורות ההתכה של הפריימר וטמפרטורות החישול המומלצות תואמות. לאחר השלמת עיצוב הפריימר עבור הפלסמידים הרצויים, לחץ על סיום באשף ההרכבה.
באמצעות ניסוי PCR הדרגתי עם תבניות DNA, בדוק זוגות פריימר ספציפיים לווקטור עבור טמפרטורות חישול אופטימליות. לאחר קביעת טמפרטורות החישול, צור אליציטוטים של תמיסות פריימר, תבניות DNA וריאגנטים נחוצים לתגובות PCR לתלמידים. כדי להתחיל, להשיג פריימרים ותבניות DNA פתרונות עבור PCR מהמדריך.
באמצעות ריאגנטים המוצגים כאן, להכין תגובות PCR 25 מיקרוליטר כדי לקבל מקטעים ליניאריים של רצפי DNA רצויים. מחזור התגובה ב thermocycler. יש לוודא שטמפרטורת החישול מתאימה לפריימרים ושזמן ההארכה מתאים לאורך האמפליקון הרצוי.
לאחר מכן, לנתח חמישה מיקרוליטר של כל תגובה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose. בזמן שהג'ל פועל, הוסיפו מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת DpnI לכל תגובה שהשתמשה בדנ"א פלסמיד כתבנית. לדגור על תערובת זו במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן דמיינו את הג'ל כדי לאשר שה-PCR הצליח והושגה הגברה נכונה. לטהר תגובות PCR מוצלחות באמצעות ערכת טיהור PCR זמינה מסחרית. מדוד את הריכוז של מוצר PCR מטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח לשימוש בחישובי הרכבה עוקבים של Gibson.
פיפטה רכיבי התגובה להרכבה של גיבסון. לדגור את התגובה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בזמן שהתגובות דוגרות, מפשירים תאי Escherichia coli בעלי כשירות כימית על קרח לצורך טרנספורמציה.
הפוך שני מיקרוליטרים של תגובת ההרכבה של גיבסון לתאים בעלי כשירות כימית באמצעות הלם חום. פיפטה 100 מיקרוליטר של התאים שעברו טרנספורמציה על שתי צלחות בחירה והתפשטו בחרוזים מעוקרים. דוגרים על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, אחסנו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן ספרו מושבות על כל הלוחות, וחשבו את יעילות הטרנספורמציה באמצעות הנוסחה הנתונה. באמצעות טוש, בחר ותייג ארבע מושבות נפרדות על לוחית הבחירה עם ראשי התיבות של התלמיד ומספר.
קחו צלחת אגר LB חדשה המכילה אנטיביוטיקה לבחירה וחלקו אותה לרבעים. השתמשו בכמחצית מכל מושבה כדי להישען על הרביע המתאים. הוסף את ריכוז האנטיביוטיקה הנכון לצינורות המסומנים בזהות המושבה לבחירה.
לאחר מכן לחסן תרבית LB נוזלית של חמישה מיליליטר עם החצי השני של כל אחת מארבע המושבות שנבחרו. דוגרים על התרביות הנוזליות באינקובטור מטלטל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ועל צלחת האגר באינקובטור סטטי באותה טמפרטורה. בודדו DNA פלסמיד מהתרביות הנוזליות באמצעות ערכת הכנה קטנה.
למדוד את ריכוז הדנ"א פלסמיד מבודד בננוגרם למיקרוליטר. לאחר תכנון מסך PCR תקציר הגבלה לניתוח הפלסמידים המבודדים, פיפטה תגובות תקציר ההגבלה, או תגובות PCR. לאחר מכן לנתח את התוצאות על ידי אלקטרופורזה ג'ל.
לאחר השלמת מודול ההרכבה של גיבסון, בקשו ממשתתפי הסטודנטים למלא את השאלון רב ברירה בפגישת המעבדה. שלב את כל הנתונים מהתשובות לפני ואחרי השאלון לניתוח, והערך את מובהקותם הסטטיסטית. לאחר הפרויקט, ציון התוכן הממוצע עלה באופן משמעותי מ-63.7% ל-80.4%, מה שמצביע על שיפור בהבנת התלמידים של ביולוגיה מולקולרית ומושגי שיבוט.
הביטחון הממוצע בטווח גדל באופן משמעותי מ-3.52 ל-3.87, כאשר גודל ההשפעה הגדול מדגים הבנה משופרת של התלמידים במונחים של ביולוגיה מולקולרית. הביטחון של הסטודנט הממוצע בביצוע טכניקות מעבדה עלה באופן משמעותי מ -3.82 ל -4.33, מה שמראה נוחות משופרת עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית. מספר התשובות שהצביעו על היכרות עם המונח אסיפת גיבסון גדל משמעותית מהשאלון שלפני לאחריו, עם עלייה ניכרת באלה שיכלו להסביר את המונח.
הביטחון בביצוע טכניקת ההרכבה של גיבסון השתפר עם רוב התגובות, ועבר מנייטרלי או לא מסכים לפני הפגישה להסכמה או הסכמה חזקה אחריה. אמון התלמידים בנושאי ביולוגיה כללית לא הראה שינויים מובהקים סטטיסטית. לעומת זאת, הביטחון בשאלות הרכבה מיוחדות של גיבסון עלה באופן משמעותי.
